Introduction
La technique CRISPR-Cas9, souvent décrite comme des « ciseaux moléculaires », a révolutionné le domaine de la génétique en permettant de modifier l'ADN avec une précision sans précédent. Cette innovation, fruit de décennies de recherche, ouvre des perspectives considérables en matière de thérapie génique et d'étude du génome. Cependant, son application, notamment sur l'embryon humain, soulève des questions éthiques et de sécurité majeures.
Contexte et enjeux
La technique CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 est une technique récente qui permet de modifier le génome d’une cellule, qu’elle soit d’origine végétale, animale ou humaine. Elle est plus rapide, plus facile à utiliser et moins coûteuse que les techniques plus anciennes de modification génomique, ce qui l’a rendue accessible à la plupart des laboratoires.
Le système CRISPR-Cas9 est composé de deux éléments principaux :
- Un ARN guide (CRISPR pour Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) : il reconnaît la séquence cible à couper sur l'ADN. Cet ARN est conçu pour être complémentaire à la séquence d'ADN que l'on souhaite modifier.
- Une nucléase Cas (le plus souvent Cas9) : c'est une enzyme qui coupe l'ADN à l'endroit précis ciblé par l'ARN guide.
Le processus de modification génomique se déroule en plusieurs étapes :
L'ARN guide se lie à la séquence d'ADN cible.
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La protéine Cas9 se fixe à l'ARN guide et coupe les deux brins de l'ADN à l'endroit précis.
La cellule met en œuvre des mécanismes de réparation de l'ADN. Il existe deux principaux mécanismes de réparation :
- La jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) : les deux extrémités de l'ADN sont simplement raboutées, ce qui peut entraîner des mutations aléatoires (insertions ou délétions) et inactiver le gène ciblé.
- La recombinaison homologue (HR) : si un ADN modèle contenant la séquence désirée est fourni à la cellule, elle l'utilise pour réparer la coupure, permettant ainsi d'insérer ou de corriger un gène spécifique.
Applications chez l’homme
Chez l’homme, cette technique ouvre la voie à une meilleure compréhension du fonctionnement des gènes et doit permettre de développer de nouveaux traitements. En supprimant les séquences d’ADN dysfonctionnelles, il serait donc possible, non seulement de soigner plusieurs maladies, mais aussi d’éviter leur transmission aux générations suivantes.
Il semble donc y avoir un intérêt potentiel majeur à pouvoir utiliser cette technique chez l’homme pour prévenir les conséquences de certaines anomalies génétiques ou pour les traiter.
Comprendre le génome et l'édition génomique
L'information génétique et son support
Les caractéristiques d’un être vivant sont contrôlées à la fois par son environnement et par son information génétique. L’information génétique est l’ensemble des instructions mises en œuvre dans la fabrication, ou la croissance, d’un être vivant : elle permet, par exemple, à un animal de fabriquer davantage de lui-même à partir d’une nourriture qui est de constitution différente de la sienne (le lapin fabrique de la matière « lapin » en mangeant des carottes).
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Matériellement, cette information est portée par les molécules d’ADN (acide désoxyribonucléique), qui se trouvent dans pratiquement toutes les cellules. La molécule d’ADN forme une longue double hélice, dont les deux brins s’enroulent l’un autour de l’autre. Des machineries cellulaires spécialisées copient la séquence de l’ADN en une molécule de nature chimique très proche, l’ARN (acide ribonucléique). Certains ARN ont une activité biologique par eux‑mêmes ; d’autres servent de programmes dirigeant la synthèse des protéines (la molécule d’ARN est lue par une machinerie cellulaire qui fabrique une protéine dont la nature dépend de la séquence de l’ARN).
On appelle « génome » la totalité de la séquence d’ADN d’un individu (à de très rares exceptions près, toutes les cellules d’un même individu portent la même séquence d’ADN). Chez les animaux et les plantes, seule une petite partie du génome semble indiscutablement fonctionnelle (de nombreuses régions génomiques sont même rarement copiées sous forme d’ARN, il n’est pas clair qu’elles jouent un rôle biologique). Les régions fonctionnelles sont dispersées le long du génome, en de petites unités individuelles appelées « gènes ». Les gènes sont donc des modules fonctionnels : un gène contient l’information qui permet la synthèse d’un ARN ou d’une protéine (parfois : de plusieurs ARN ou protéines similaires entre eux), et cet ARN ou protéine conférera à la cellule une propriété particulière.
Les gènes sont exprimés ou non, selon les types cellulaires (les gènes des kératines sont fortement exprimés dans les cellules de la peau : ces cellules vont donc se remplir de kératines, protéines qui leur confèrent leur résistance mécanique ; les neurones expriment les gènes de protéines réceptrices qui les rendent sensibles aux signaux émis par d’autres neurones ; etc.). Parmi ces mécanismes, certains contrôlent la copie de l’ADN en ARN, d’autres contrôlent la synthèse de protéine à partir d’un ARN, d’autres contrôlent l’activité des protéines elles‑mêmes. La plupart de ces mécanismes impliquent la reconnaissance d’un gène‑cible ou d’un ARN‑cible par une protéine régulatrice (qui, en interagissant avec ses molécules‑cibles, va moduler leur expression). Notamment, il est établi que des modifications chimiques de l’ADN, ou des protéines qui lui sont associées, a tendance à affecter l’expression des gènes du voisinage. On appelle « épigénome » l’ensemble des modifications chimiques portées par l’ADN ou par ses protéines associées.
L'édition du génome : modifier l'ADN
Une grande partie du travail des généticiens consiste à identifier les fonctions biologiques des gènes. Alors qu’il est facile de mesurer l’expression des gènes (donc, de déterminer dans quelles cellules ils sont copiés sous forme d’ARN, et de comparer quantitativement les niveaux d’expression dans des types cellulaires différents), il est souvent plus difficile de comprendre le mode d’action des ARN ou protéines produits par les gènes. Une méthode d’analyse convaincante consiste à inactiver ce gène (par exemple, en modifiant sa séquence pour le rendre incapable de guider la production d’une protéine, ou pour le rendre impropre à la copie sous forme d’ARN), pour ensuite évaluer les conséquences de cette inactivation sur la biologie de l’organisme.
Modifier un fragment du génome, en remplaçant sa séquence par une séquence choisie par l’expérimentateur, est appelé « éditer le génome ». Jusqu’à récemment, l’édition du génome était très difficile chez la plupart des organismes. Alors que des méthodes simples et efficaces existaient depuis longtemps pour modifier le génome de la levure (un champignon unicellulaire), la modification contrôlée du génome était d’une grande difficulté chez les animaux et les plantes. Difficile, mais pas tout à fait impossible : il était possible d’utiliser un mécanisme naturel de réparation de l’ADN, appelé « recombinaison homologue ». Ce phénomène est très répandu chez les espèces vivantes : il permet aux cellules de réparer l’ADN lorsqu’il a subi un dommage, en prenant comme modèle une autre molécule d’ADN de séquence similaire (sur la molécule endommagée, le dommage est remplacé par un fragment d’ADN copié sur l’ADN‑modèle). Pour éditer une séquence donnée sur le génome, il faut donc commencer par couper l’ADN‑cible, tout en fournissant à la cellule un ADN de séquence similaire, mais contenant la séquence qu’on souhaite voir introduite.
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Lorsque, suite à un accident quelconque, l’ADN est coupé, des machineries cellulaires spécialisées peuvent réparer la coupure selon plusieurs mécanismes. À gauche : dans le premier mécanisme, appelé non-homologous end joining, les deux fragments sont simplement raboutés l’un à l’autre (si ce processus est lent, il arrive que les fragments soient partiellement modifiés par des enzymes cellulaires avant le raboutage, ce qui peut conduire à l’apparition de petites délétions ou insertions de séquence à l’endroit de la coupure). À droite : dans le deuxième mécanisme, appelé « recombinaison homologue », la machinerie de réparation utilise un ADN-modèle (ici en orange), dont la séquence contient de longs segments d’identité à celle de l’ADN à réparer, et elle copie cet ADN‑modèle dans l’intervalle à rabouter. La recombinaison homologue offre donc la possibilité d’introduire une séquence quelconque, choisie par l’expérimentateur, à l’endroit où l’ADN a été coupé.
On connaît quelques enzymes (les « méganucléases ») qui coupent l’ADN quand il porte une séquence bien spécifique, et assez longue (de l’ordre d’une vingtaine de caractères A, C, G et T). Le motif de séquence reconnu par ces enzymes est tellement long qu’il est très rare dans les génomes (en général, ces enzymes n’ont pas plus d’un site de reconnaissance par génome), ce qui garantit qu’elles ne couperont l’ADN qu’à un seul endroit… mais ce qui implique, également, que l’expérimentateur n’aura pas le choix de l’endroit où l’enzyme coupera. On commence à connaître assez bien les règles de reconnaissance de l’ADN par les protéines. Il est donc possible, dans une certaine mesure, de produire des enzymes artificielles, protéines dont la nature aura été choisie pour qu’elles se fixent sur une séquence d’ADN d’intérêt, et la coupent.
L'origine de CRISPR-Cas9 : un système de défense bactérien
La découverte du système CRISPR/Cas9 découle de l’étude d’un système de défense des bactéries contre leurs pathogènes. Certaines bactéries (à peu près la moitié des espèces étudiées) possèdent, à un endroit de leur génome, des séquences répétées à intervalles réguliers. Chacune des copies se trouve être, de plus, une séquence « palindromique » (c’est‑à‑dire qu’elle est identique si on la lit de gauche à droite, ou de droite à gauche). Ces curieuses répétitions génomiques, identifiées dans les années 1980 et 1990, ont donc été baptisées « CRISPR », pour « Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats » (soit : répétitions palindromiques courtes, regroupées et régulièrement réparties).
L’observation, en 2005, que ces séquences intercalaires, non‑répétées, provenaient du génome de bactériophages ou d’ADN invasifs, a suggéré qu’elles participaient à un mécanisme de défense contre ces pathogènes. Cette hypothèse a été confirmée en 2007, quand il est apparu qu’on pouvait conférer à une bactérie une résistance face à un pathogène, si on modifiait une séquence intercalaire pour la rendre spécifique de ce pathogène.
Le mécanisme de cette résistance aux pathogènes a été élucidé dans les années suivantes : des protéines appelées « protéines Cas » (pour : « CRISPR‑associated », associées aux CRISPR) permettent l’introduction de morceaux de séquence de pathogènes dans cette région génomique, quand la cellule est infectée ; d’autres protéines Cas fabriquent des ARN de taille et de repliement spatial homogènes, à partir de ces séquences intercalaires ; ces ARN sont ensuite chargés sur une autre protéine Cas (celle qu’on appelle Cas9) : cet assemblage ARN/protéine est capable de reconnaître les ADN qui portent la même séquence que l’ARN, et de les dégrader.
L’ARN-guide peut reconnaître les ADN qui portent la même séquence que lui : dans l’ADN double-brin, si un brin porte la même séquence que celle de l’ARN, alors l’autre brin d’ADN porte une séquence qui lui est complémentaire. L’ARN est donc capable de s’apparier avec ce deuxième brin, et de former une double hélice ADN/ARN. Cet appariement stabilise l’interaction entre la protéine Cas9 et l’ADN, et laisse le temps à la protéine Cas9 de couper l’ADN à une position spécifique. À noter : les protéines Cas9 des différentes bactéries ont également besoin que l’ADN-cible porte un motif de séquence particulier, appelé « PAM » (pour : « protospacer adjacent motif », motif adjacent à la séquence intercalaire). Cette limitation ne permet donc pas au système CRISPR/Cas9 de couper n’importe quel ADN, seulement ceux qui portent un PAM à proximité de la séquence-cible.
La découverte de ce système a permis de mieux comprendre l’immunité des bactéries vis‑à‑vis de leurs pathogènes. Elle a également permis une application biotechnologique utile : puisque Cas9 coupe les ADN qui présentent une séquence identique à celle de l’ARN-guide, il est donc possible de programmer Cas9 pour qu’elle aille couper un ADN-cible quelconque, choisi par l’expérimentateur (il suffit juste de lui fournir un ARN‑guide spécifique de la cible visée).
L'édition du génome facilitée par CRISPR-Cas9
La découverte du fonctionnement de Cas9 a donc ouvert la voie de l’édition du génome de manière simple : en introduisant, dans les cellules‑cibles, la protéine Cas9 et l’ARN‑guide (ou alors : des ADN portant les gènes de Cas9 et de l’ARN, que la cellule elle-même utilisera pour les fabriquer in situ), ainsi qu’un ADN‑modèle portant la séquence qu’on souhaite voir introduite dans la région génomique visée, il devient possible d’éditer à volonté à peu près n’importe quelle cible génomique.
Naturellement, il reste encore à pouvoir introduire dans les cellules la protéine Cas9 et l’ARN‑guide, ou un ADN portant leurs gènes, ainsi que l’ADN‑modèle. Mais il se trouve que des protocoles bien optimisés sont disponibles depuis longtemps pour ce genre d’opération : bien avant la découverte du fonctionnement de Cas9, la communauté scientifique avait dû mettre au point des techniques d’introduction d’ADN, d’ARN ou de protéines dans les cellules, pour d’autres types d’expérience. Des protocoles efficaces existaient donc déjà, pour permettre d’introduire tous ces réactifs dans des cellules en culture, ou dans des œufs fécondés.
Introduire une modification génétique dans un œuf fécondé (plutôt que dans une cellule adulte) a l’avantage de permettre l’obtention d’un organisme entièrement modifié, sur l’ensemble de ses cellules : puisque l’organisme est issu d’un œuf fécondé, qui s’est divisé de nombreuses fois, chaque cellule de l’organisme final contient le même ADN que l’œuf fécondé initial.
L’une des limitations de la technique tient à sa spécificité : on aimerait s’assurer que seule la région ciblée, et aucune autre, a été coupée par Cas9. Rien n’est jamais parfait, et il est connu que Cas9 a tendance à reconnaître des séquences d’ADN qui ne sont qu’imparfaitement identiques à celle de son ARN‑guide.
Rapidement, il est apparu que Cas9 pouvait même servir à d’autres usages que l’édition du génome. On peut la muter, de manière à la rendre incapable de couper l’ADN. Guidée par un ARN, elle va donc reconnaître une région‑cible sur le génome, mais y rester associée sans la couper. Elle peut donc servir de plateforme pour attirer d’autres types d’enzymes sur la région cible. Par exemple, on peut préparer un gène artificiel, qui fusionne le gène Cas9 avec le gène d’une enzyme de modification de l’épigénome (une de ces enzymes qui déposent des modifications chimiques sur l’ADN ou sur ses protéines associées ; voir section).
La simplicité d’utilisation de Cas9, sa grande efficacité, et sa capacité à réaliser des interventions qui étaient impossibles jusque-là (éditer le génome ou l’épigénome pratiquement à volonté), lui a valu un grand succès dans les laboratoires de recherche, qui avaient besoin de ce genre d’outils pour explorer les fonctions du génome et de l’épigénome.
CRISPR-Cas9 et l'embryon humain : perspectives et limites
Applications potentielles et recherche
Cas9 est une protéine bactérienne, qui fonctionne sur l’ADN - or tous les êtres vivants portent leur information génétique sur de l’ADN. C’est ce qui explique le succès de la technologie Cas9 dans une grande variété d’espèces, pas uniquement chez les bactéries.
La production d’organismes génétiquement modifiés est contrôlée, dans tous les États où elle est techniquement possible (c’est à dire, les États disposant d’infrastructures de recherche suffisamment développées). Dans certains pays toutefois, la recherche sur l’embryon humain est autorisée, du moment que les embryons modifiés ne sont ensuite pas implantés chez une mère porteuse (on ne leur permet pas de se développer pour donner un individu à naître). Il est donc possible, dans ces pays, d’essayer d’utiliser Cas9 pour modifier le génome humain, ce qui accélérerait la mise au point de la thérapie génique.
À la fin de l’été 2017, une publication a ainsi présenté les résultats de ses essais de correction de mutation causant une maladie génétique, sur des embryons humains qui sont restés viables après traitement (et qui auraient donc pu être implantés dans une mère porteuse). Les statistiques étaient impressionnantes, elles suggéraient que la correction était très efficace. Même s’il s’avère que les auteurs ont effectivement surestimé le succès de leur méthode, il faut s’attendre à ce que, dans les prochaines années, de nouveaux articles, moins controversés, décrivent des modifications réussies du génome d’embryons humains.
Il est donc utile de continuer à réfléchir aux implications de ces travaux sur la société : s’il devient possible de guérir des maladies génétiques avant implantation, est-il souhaitable de le faire ? Est-il préférable de modifier génétiquement un embryon porteur de la maladie, ou de sélectionner (parmi une collection d’embryons) les embryons qui ne sont pas porteurs, et n’implanter que ceux-là ? Plus généralement, quels sont les risques qu’apporte la possibilité de modifier le génome humain ?
Des équipes chinoises et américaines ont testé la technique CRISPR-Cas9 chez l’embryon humain pour corriger une mutation conférant la bêta-thalassémie ou une autre mutation associée à une pathologie cardiaque grave. Il s’agit de recherche fondamentale destinée à évaluer l’efficacité et la sécurité de CRISPR-Cas9 sur des embryons qui sont ensuite détruits. Les effets jusqu’ici obtenus restent largement perfectibles : le pourcentage d’embryons modifiés est faible et le risque de mosaïcisme (c’est-à-dire le risque que les cellules d’un même embryon ne possèdent pas toutes le même patrimoine génétique) est élevé.
Les risques et les limites
Comme pour tous les médicaments, un risque majeur de l’édition génomique en thérapie est celui d’avoir des effets indésirables. Dans le cas de l’édition génomique, il existe en particulier un risque de créer des mutations hors cible, en dehors de la zone initialement visée. Les nucléases ciblent en effet des séquences spécifiques d’une longueur de 15-20 bases, mais elles peuvent couper « par erreur » des séquences très proches qui ne se distinguent que par une seule base. Ces mutations non désirées peuvent modifier l’expression de gènes qui n’étaient pas ciblés.
L’une des limitations de la technique tient à sa spécificité : on aimerait s’assurer que seule la région ciblée, et aucune autre, a été coupée par Cas9. Rien n’est jamais parfait, et il est connu que Cas9 a tendance à reconnaître des séquences d’ADN qui ne sont qu’imparfaitement identiques à celle de son ARN‑guide.
Au lieu de cela, parfois, le système rate son entrée in vitro dans la cellule ou bien se trompe de cible. « Et après une dizaine d’heures, le CRISPR Cas9 se désagrège sans laisser de traces », signale Jean-Claude Chambard, chercheur à l’Institut de biologie Valrose (iBV).
Enjeux éthiques et réglementations
Concernant des modifications génétiques qui seraient transmissibles à la descendance, la France a ratifié la convention d’Oviedo qui interdit d’effectuer ce type de travaux. Pour de nombreux organismes scientifiques et comités éthiques, dont celui de l’Inserm, même si la convention d’Oviedo était modifiée, il est à ce stade inenvisageable de recourir à une intervention chez un embryon qui serait destiné à faire naitre un enfant, faute de garanties d’efficacité et de sécurité suffisantes.
L’option la plus inquiétante implique des modifications héritables, c’est-à-dire concernant soit le gamète soit l’embryon. Dans ces cas, les modifications seront transmises à la descendance du patient. Cette pratique est interdite dans la plupart des pays du monde. Il existe toutefois des zones grises sur le plan légal, dans lesquelles des cliniques peu scrupuleuses peuvent s’engager.
Pourtant, en l’état actuel de la science, il est irresponsable de modifier le génome d’un individu de manière héritable : les mécanismes de modification de l’ADN ne sont pas les mêmes dans les cellules somatiques (qui assurent le fonctionnement et la structure de l’organisme) et dans les cellules germinales (susceptibles de former les gamètes et dont le matériel génétique peut être transmis à la descendance). Une modification héritable du génome devra répondre à une triple pertinence : scientifique, médicale et sociétale.
L’OMS a choisi de proposer un cadre de gouvernance plutôt que de tenir une convention internationale. Si le recours aux outils d’édition du génome pour traiter un cancer ne heurte pas par principe la bioéthique, d’autres finalités sont discutables.
Les alternatives à CRISPR-Cas9
Si CRISPR-Cas9 constitue une avancée révolutionnaire, d’autres techniques d’édition du génome existaient avant elle. Frédéric Causeret, chercheur en neurosciences, les utilisait auparavant sur ses souris, pour étudier notamment leur développement cérébral. Pourtant, il envisage désormais d’avoir recours à CRISPR-Cas9 dans les mois qui viennent.
Les nucléases à doigts de zinc (ZFN)
Ces protéines artificielles sont composées de peptides dits à doigts de zinc, qui reconnaissent une séquence d’ADN, et d’une nucléase (FokI) qui coupe l’ADN. Chaque peptide à doigt de zinc reconnaît une courte séquence de trois nucléotides : l’assemblage de plusieurs d’entre eux permet de cibler des séquences plus longues, de manière plus spécifique. En outre, pour couper, les nucléases à doigt de zinc agissent à deux, sur deux sites proches l’un de l’autre. Cela permet une action catalytique des enzymes FokI. Une modification génomique nécessite donc deux nucléases à doigts de zinc, dont la construction et l’assemblage sont très complexes. Cela limite leur utilisation.
Les TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)
Les TALENs sont également utilisés par paires, ciblant deux séquences d’ADN proches. Ils comprennent un domaine de fixation à l’ADN composé d’une combinaison de quatre peptides, chacun de ces peptides reconnaissant spécifiquement une des quatre bases de l’ADN. En jouant sur l’enchainement de ces peptides, il est possible de cibler une séquence d’ADN spécifique. Ce domaine de fixation est associé à une nucléase Fok1 qui assure la coupure double brin. Comme avec les nucléases à doigt de zinc, un travail d’ingénierie protéique est nécessaire pour construire et assembler les TALENs destinés à l’édition génomique. Des programmes informatiques permettent de faciliter ce travail comme E‑Talen et une bibliothèque de TALENs pouvant reconnaitre plus de 18 700 gènes est disponible. Les TALENs sont plus faciles à produire que les nucléases à doigt de zinc et présentent une très bonne efficacité.
Avantages de CRISPR-Cas9 par rapport aux autres techniques
CRISPR-Cas9 a révolutionné l’édition génomique par sa simplicité. Les scientifiques l’utilisent désormais quotidiennement dans tous les domaines de recherche : médecine, agronomie, environnement, etc. Fabriquer des ARN guides est infiniment plus facile que fabriquer des protéines. C’est aussi beaucoup plus rapide (quelques jours, contre plusieurs semaines ou mois pour la fabrication de nucléases à doigt de zinc ou de TALENs) et beaucoup moins coûteux.
"Alors qu’avec l’ancienne technique il faut près d’un an pour obtenir une souris avec la mutation souhaitée, le CRISPR permet d’obtenir ces modifications en deux mois à peine. Et à moindre coût ! souris mutantes valent parfois jusqu’à 50 000 euros."
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