Introduction
La microscopie à contraste de phase est une technique d'imagerie optique qui augmente le contraste des échantillons transparents. Elle permet d'obtenir des images à contraste élevé de cellules vivantes, de micro-organismes et d'autres échantillons sans avoir recours à des colorants ou à des techniques de préparation invasives. Inventée par le physicien hollandais Frits Zernike en 1932 (prix Nobel de physique en 1953), cette technique est essentielle pour l'observation des cellules vivantes dans leur état naturel.
Principes de la Microscopie à Contraste de Phase
Le défi de l'observation des cellules vivantes
Les cellules vivantes sont pratiquement transparentes, ce qui rend difficile l'observation de leurs détails et structures microscopiques à l'aide de microscopes conventionnels à lumière transmise. L'utilisation de colorants peut être incompatible avec la survie des cellules.
Manipulation de la lumière pour augmenter le contraste
Le microscope à contraste de phase manipule la lumière pour augmenter le contraste de l'échantillon observé. Il exploite les petites différences d'indices de réfraction dans différentes parties d'une cellule ou d'un échantillon de tissu.
Composants clés et fonctionnement
- Source de lumière : Un projecteur éclaire l'échantillon.
- Lumière d'éclairage et lumière diffusée : Lorsque la lumière traverse l'échantillon, ses ondes sont affectées de différentes manières. La lumière d'éclairage traverse l'échantillon sans subir de changement. La lumière diffusée subit un changement de phase dû à l'indice de réfraction de l'échantillon. La lumière se déplace légèrement plus lentement lorsqu'elle traverse l'échantillon.
- Condenseur annulaire : Plaque opaque avec un anneau transparent, positionnée dans le plan focal avant.
- Lame de phase : Montée à l'arrière de l'objectif, elle modifie sélectivement la phase et l'amplitude de la lumière traversant l'échantillon. La lumière passant à travers les régions d’indice de réfraction plus élevé est déviée et déphasée avec le faisceau principal d’ondes lumineuses qui ont traversé l’échantillon.
- Formation de l'image : Le microscope couple d’autres longueurs d’onde déphasées via une série d’anneaux optiques de lentilles et de condensateurs, annule l’amplitude de la partie déphasée initiale du faisceau lumineux et produit un contraste utile sur l’image.
Avantages de la technique
L'avantage principal de la technique de contraste de phase est que les cellules et les tissus vivants n'ont pas besoin d'être tués, fixés, colorés ou préparés de quelque manière que ce soit. Ils peuvent être examinés dans leur état naturel.
Caractéristiques de l'Image en Contraste de Phase
Une image typique en contraste de phase a un fond neutre avec un contraste variable où la lumière est modifiée par l'échantillon.
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Halo et Shade-Off
Deux effets courants observés dans une image en contraste de phase sont le halo et les motifs d'ombrage. Ils se produisent lorsque le point focal infini-conjugué ne correspond pas à l'échantillon et à l'arrière-plan. Bien qu'ils soient courants et attendus, ils diminuent l'apparence des détails. Un halo de contraste de phase brillant est généralement visible à une limite entre les caractéristiques fortes et faibles de l'échantillon. Ces halos sont évidents en raison des anneaux circulaires de retard de phase.
Traduction des variations de phase en amplitude
La technique de contraste de phase traduit de très petites variations de phase en un changement d'amplitude notable et correspondant. Cela se traduit par une différence de contraste dans l'image.
Applications de la Microscopie à Contraste de Phase
Le microscope à contraste de phase est un instrument permettant d’observer toutes sortes d’échantillons vivants (cellules, micro-organismes, tissus) sans avoir besoin d’utiliser de colorants. Il est largement utilisé dans divers domaines de la recherche biologique et médicale.
Observation de cellules vivantes et de micro-organismes
La microscopie à contraste de phase est idéale pour l'observation de cellules vivantes, de bactéries, de levures et d'autres micro-organismes. Elle permet de visualiser les structures internes et les processus cellulaires en temps réel sans perturber la viabilité des cellules.
Étude des tissus et des cultures cellulaires
Elle est utilisée pour examiner les tissus biologiques et les cultures cellulaires, permettant l'observation des détails cellulaires et tissulaires.
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Analyse de la morphologie cellulaire
La technique permet d'analyser la morphologie cellulaire, y compris la taille, la forme et l'organisation des cellules.
Amélioration d'un Microscope à Fond Clair en Microscope à Contraste de Phase
Un microscope à illumination à fond clair peut être transformé en un microscope à fond clair-phase en ajoutant deux composants au train optique : la lame de phase et le condenseur annulaire.
Microscopie de Fluorescence : Une Technique Complémentaire
La microscopie de fluorescence est une autre technique d'observation optique microscopique qui utilise la lumière d'une longueur d'onde spécifique pour irradier l'objet inspecté afin de produire une fluorescence pour l'inspection microscopique.
Principes de la microscopie de fluorescence
Un microscope à fluorescence utilise l'imagerie par « fluorescence actinique ». La source de lumière fluorescente est allumée pendant environ 5 à 10 minutes pour stabiliser l'intensité de la lumière d'excitation. Pour éviter l'extinction de la fluorescence de l'échantillon causée par une lumière d'excitation excessive pendant le processus de mise au point et de recherche d'objets, il est préférable de faire un zoom arrière au préalable. Le diaphragme d'ouverture de l'illuminateur de fluorescence ou le filtre ND peut être utilisé pour ajuster la lumière d'excitation à une intensité modérée, et la platine de l'échantillon est déplacée régulièrement.
Précautions pour l'utilisation d'un microscope à fluorescence
- Vérifiez si le support d'échantillon (lame de verre, verre de protection et autres ustensiles) est recouvert de liquide ou de poussière et si l'épaisseur se situe dans la plage de distance de travail calibrée de l'objectif.
- Pour prolonger la durée de vie de la lampe à mercure, elle peut être éteinte 15 minutes après son allumage. Une fois que la puissance fluorescente de la lampe à mercure est éteinte, il faut attendre au moins 10 minutes pour que la vapeur de mercure redémarre et refroidisse et revienne à son état d'origine.
- Ajustez la compensation d'exposition en fonction du rapport de distribution de l'image de l'objet fluorescent dans la zone de mesure et de la luminosité et de l'obscurité de l'image miroir.
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