La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique d'analyse largement employée en chimie pour séparer et identifier les composants d'un mélange. Elle est un outil essentiel pour l'analyse et la séparation de mélanges en laboratoire. Cette méthode repose sur le principe de la migration différentielle des composés en fonction de leur affinité pour deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile.
Principe de la Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
Le principe de la CCM repose sur l'adsorption. Certaines molécules peuvent se fixer momentanément à la surface de particules solides : c'est le phénomène d'adsorbance ; le solide est appelé adsorbant. Lorsqu'on fait circuler ces molécules à travers un adsorbant, leur vitesse de déplacement est d'autant plus faible que l'adsorbance est plus forte : des molécules d'adsorbances différentes vont donc se déplacer à des vitesses différentes et vont ainsi pouvoir être séparées. Les molécules sont entraînées par un gaz ou un liquide appelé éluant. La vitesse d'entraînement des molécules dépend aussi de leur affinité avec l'éluant.
La phase stationnaire est généralement une fine couche d'adsorbant, comme la silice gelée, déposée sur une plaque en verre ou en plastique. La phase mobile, quant à elle, est un solvant ou un mélange de solvants qui migre par capillarité à travers la couche stationnaire. L'éluant monte par capillarité dans l'adsorbant, entraînant les différents composants à des vitesses différentes.
Matériel et Préparation
Pour réaliser une CCM, on utilise :
- Plaques CCM : Une couche mince d'alumine ou de silice est déposée sur un support de polyester, de mylar, d'aluminium ou de verre. Humeau propose une large gamme de plaques CCM de qualité, disponibles en différentes formes, tailles et phases stationnaires pour s'adapter à tous types d'analyses. La taille des plaques de CCM est conditionnée par les dimensions de la cuve.
- Cuve : Un récipient haut (par exemple un becher) appelé "cuve" au fond duquel on verse une faible quantité d'éluant. Les pots de "Blédine", présentant un rebord sur lequel on peut appuyer le haut de la plaque, permettent d'éviter les contacts avec les bords de la cuve.
- Éluant : On utilise un récipient haut (par exemple un becher) appelé " cuve " au fond duquel on verse une faible quantité d'éluant. On place contre les bords de la cuve un morceau de papier filtre : l'éluant va monter par capillarité et assurera ainsi une meilleure saturation de la cuve. La saturation est nécessaire pour éviter l'évaporation de l'éluant pendant son ascension le long de la plaque. L'éluant utilisé doit être adapté aux composés à séparer.
- Capillaire : Pour le dépôt des espèces chimiques sur la plaque.
Préparation de la cuve
On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci. Placer contre les bords de la cuve un morceau de papier filtre : l'éluant va monter par capillarité et assurera ainsi une meilleure saturation de la cuve. La saturation est nécessaire pour éviter l'évaporation de l'éluant pendant son ascension le long de la plaque. Rajouter un peu d'éluant si cela semble nécessaire.
Lire aussi: Principes de la Chromatographie sur Couche Mince
Préparation de la plaque
Sur une " plaque " constituée d'un support sur lequel est déposé l'adsorbant, adapté à la dimension de la cuve, on dépose une micro-goutte du corps à étudier et éventuellement des réactifs de référence. A environ un centimètre du bord de la plaque de chromatographie, tracez un trait fin au crayon, sans appuyer, afin de ne pas abîmer la couche d'adsorbant. Ce trait (ligne de base) servira de repère pour déterminer les longueurs de migration; Marquer délicatement deux, trois ou quatre points sur la ligne de base, qui serviront à repérer la position des dépôts du mélange d'huiles essentielles et des solutions de référence. On trace un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes.
Procédure de la Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
- Préparation de la plaque : A 1cm de l'un des petits côtés de chaque plaque marquer un trait fin au crayon (ligne de base). ATTENTION : NE PAS APPUYER POUR CONSERVER INTACT L'ADSORBANT.
- Dépôt de l'échantillon : L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches. Plonger délicatement une pipette pasteur dans le filtrat et en déposer par capillarité une goutte au milieu du trait précédemment marqué. Laisser sécher la plaque et recommencer 4 ou 5 fois de manière que la quantité de colorant soit suffisante. Le dépôt sur la ligne de base doit être assez important pour que la chromatographie soit bien visible. Il faut laisser sécher environ 2mn entre deux dépôts, pour que la tâche n'excède pas 5mm.
- Élution : On utilise un récipient haut (par exemple un becher) appelé " cuve " au fond duquel on verse une faible quantité d'éluant. On place contre les bords de la cuve un morceau de papier filtre : l'éluant va monter par capillarité et assurera ainsi une meilleure saturation de la cuve. La saturation est nécessaire pour éviter l'évaporation de l'éluant pendant son ascension le long de la plaque. Placer dans chaque cuve une plaque de chromatographie. Attention à ne pas mettre les bords latéraux de la plaque en contact avec la cuve : l'éluant monterait inégalement le long de celle-ci. Couvrir chaque cuve pour éviter l'évaporation de l'éluant. NE PLUS DEPLACER LA CUVE JUSQU'A LA FIN DE L'ELUTION. La durée de l'élution est d'environ 10mn. Lorsque la plaque est sèche, la placer au milieu de la cuve, en appui sur le bord supérieur, en veillant à ce qu'elle ne touche pas les parois verticales. Observer la montée de l'éluant sur la plaque. Sortir celle-ci lorsque le solvant est arrivé à environ un centimètre du bord supérieur. Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu.
- Révélation : Les huiles essentielles n'étant pas colorées, n'apparaissent pas sur la plaque : on doit utiliser un révélateur afin de repérer leur migration. Ce révélateur est la vanilline sulfurique. Préparation : dissoudre 1g de vanilline dans 100ml d'éthanol à 95° puis placer le récipient dans un bain de glace et ajouter avec précaution 2ml d'acide sulfurique concentré. Ce révélateur est pulvérisé sur la plaque de chromatographie. La pulvérisation doit être légère pour ne pas laver la plaque. Marquer rapidement au crayon le front du solvant (le méthanol s'évapore très vite). Laisser sécher la plaque puis repérer les fronts des différents colorants.
Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Calculer les rapports frontaux Rf des différents colorants pour chaque plaque et donner votre conclusion quant à l'utilisation des deux éluants. Marquer les fronts de migration des différents constituants puis calculer les rapports frontaux.
Interprétation des Résultats
Lecture verticale : si l'espèce analysée est pure, on n'observe, pour ce dépôt, qu'une seule tache sur la plaque. Si l'espèce analysée est un mélange, on observe, pour ce dépôt, plusieurs taches sur la plaque.
Lecture horizontale : si deux dépôts font apparaître des taches à des hauteurs différentes, alors les deux espèces correspondantes sont différentes. Dans le cas contraire, il est vraisemblable que les deux espèces soient les mêmes.
Remarque : dans le cas des colorants, le résultat est immédiatement visible.
Lire aussi: Applications de la CCM aux acides aminés
Applications de la Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) trouve son application dans de nombreux domaines :
- Contrôle de qualité : Elle permet de vérifier la pureté des produits et de s'assurer de l'absence de contaminants. Tester ses produits, c’est s’assurer de ce qu’ils contiennent. Pour éviter les surdoses, les mauvaises surprises ou d’ingérer des produits de coupe toxiques.
- Identification de composés : Cette technique est utilisée pour identifier les composants d'un mélange inconnu en les comparant à des composés de référence.
- Suivi de réactions chimiques : La CCM permet de suivre la progression d'une réaction en identifiant les produits formés.
- Analyse de produits naturels : Elle est utilisée pour l'extraction et la chromatographie des colorants d'une feuille de Prunus et l'extraction et la chromatographie d'huiles essentielles de feuilles Menthe poivrée. La chromatographie de l'huile essentielle de menthe poivrée fait apparaître au moins six composants, dont les plus importants sont le menthol, la menthone et le cinéole.
- Réduction des risques : Le principe de la réduction des risques (RdR) vise, en partie, à informer les usagers concernant leurs usages, leurs modes de consommation et les risques liés aux produits qu’ils consomment. La loi de modernisation du système de santé adoptée en 2016 reconnaît aux intervenants (ça, c’est nous) la mission d’analyse de produits.
Avantages de la Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) présente de nombreux avantages :
- Simplicité et rapidité : La CCM est une technique relativement simple à mettre en œuvre et ne requiert qu'un matériel peu encombrant.
- Polyvalence : La CCM peut être utilisée pour analyser une large gamme de composés, organiques et inorganiques.
- Faible coût : La CCM est une technique relativement peu coûteuse à mettre en œuvre, ce qui la rend accessible à un large public.
- Visualisation directe : Dans le cas des colorants, le résultat est immédiatement visible.
Limites de la CCM
Bien que la CCM soit une technique précieuse, elle présente certaines limites :
- Elle ne permet pas de quantifier les principes actifs ni les adultérants (les produits de coupe) contenus dans l’échantillon.
- La CCM est plus spécifique que les tests colorimétriques puisque des standards correspondant aux molécules recherchées sont également utilisés et permettent donc de vérifier le bon emplacement de la tâche et la bonne coloration. Mais il peut y avoir présence associée de molécules ne permettant pas une identification formelle (en gros, c’est pas toujours hyper précis).
CCM et Analyse de Produits : L'Exemple des Associations
Au départ, on avait un outil bien pratique (quoique pas très précis et pas quantitatif) : la technique colorimétrique. Cette méthode utilise différents réactifs chimiques et repose sur les caractéristiques des molécules. On identifie le plus souvent une classe de composés et non un composé isolément, ce qui va permettre de positionner la substance inconnue d’une poudre dans une classe spécifique et d’éliminer d’autres classes (c’était ces fameux tests colorés qu’on trimbalait en teuf jadis). Suite à l’interdiction d’utilisation des tests colorimétriques, des associations comme Médecins du monde ont mis au point des techniques d’analyse sur site basées sur la CCM. Il s’agit d’une méthode de chromatographie sur plaque recouverte de silice sur laquelle est déposée un échantillon du produit à analyser, mis préalablement en solution.
Comment ça marche ? Cette méthode très facile à mettre en œuvre est une des principales techniques utilisées dans les laboratoires. Elle présente l’avantage de ne nécessiter que peu de matériel et de donner des résultats facilement interprétables. Les différents constituants sont ensuite révélés par la vaporisation de révélateurs laissant apparaître des taches correspondant aux différents composés séparés. Si l’échantillon correspond à une poudre pure, une seule tâche apparaîtra. La CCM est une méthode qui peut permettre facilement d’identifier une poudre pure contenant un composé bien connu (cocaïne, héroïne, MDMA, etc.), mais ces poudres pures ne circulent que très rarement.
Lire aussi: Maîtriser la CCM : Exercices et solutions
tags: #chromatographie #sur #couche #mince #principe #fonctionnement