La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique analytique largement utilisée dans les laboratoires en raison de sa simplicité, de sa rapidité et de sa polyvalence. Elle permet de séparer, d'identifier et d'évaluer la pureté des composés d'un mélange. Cet article présentera les principes de base de la CCM, en particulier son application à la séparation des acides aminés, ainsi que les procédures et analyses impliquées.
Principes de Base de la Chromatographie sur Couche Mince
La CCM est une méthode chromatographique d'adsorption qui repose sur la différence d'affinité des composés pour une phase stationnaire et une phase mobile.
- Phase Stationnaire: Une fine couche d'un matériau adsorbant, généralement du gel de silice (SiO2), de l'alumine (Al2O3) ou de la cellulose, est déposée sur un support rigide tel qu'une plaque d'aluminium, de plastique ou de verre. Le gel de silice est le support le plus courant, surtout pour les substances polaires comme les sucres ou les acides aminés.
- Phase Mobile (Éluant): Un solvant ou un mélange de solvants se déplace par capillarité le long de la phase stationnaire, entraînant les composés à séparer. Le choix de l'éluant est crucial et dépend de la polarité des composés à séparer. Des mélanges de solvants en proportions variées (par exemple, 100-0, 75-25, 50-50, 25-75) peuvent être utilisés pour ajuster la polarité de l'éluant.
La séparation des composés est basée sur l'équilibre entre leur adsorption sur la phase stationnaire et leur solubilité dans la phase mobile. Les composés ayant une plus grande affinité pour la phase mobile migrent plus rapidement, tandis que ceux ayant une plus grande affinité pour la phase stationnaire migrent plus lentement.
Protocole Expérimental de la CCM
Préparation de la Cuve et de la Plaque
- Préparation de la cuve: La cuve à chromatographie, un récipient en verre avec un couvercle, doit être préparée au moins 24 heures à l'avance en y versant environ 10 mL d'éluant, formant une couche d'environ 0,5 cm au fond. Un couvercle est indispensable pour saturer l'atmosphère de la cuve avec les vapeurs du solvant.
- Préparation de la plaque: Découper un rectangle de plaque de CCM (par exemple, 16 x 14 cm). Tracer délicatement un trait au crayon à environ 1,5 cm du bord inférieur. Cette ligne servira de ligne de dépôt pour les échantillons. Prévoir au moins 4 emplacements de dépôt espacés d'au moins 2,5 cm sur les 14 cm de longueur de la ligne.
Dépôt des Échantillons
- Dissoudre les acides aminés (par exemple, leucine, glycine) dans un solvant approprié.
- Déposer de petites quantités de chaque solution d'acide aminé sur la ligne de dépôt à l'aide d'un tube capillaire, en espaçant chaque dépôt d'environ 1 à 2 cm. Pour augmenter la concentration de l'échantillon sans élargir la tache, il est possible de superposer plusieurs microgouttes, en séchant chaque dépôt avec un sèche-cheveux avant d'appliquer la suivante. Il est important de ne pas creuser la plaque avec le capillaire.
Développement du Chromatogramme
- Placer la plaque dans la cuve à chromatographie, en veillant à ce que la ligne de dépôt soit au-dessus du niveau de l'éluant.
- Fermer la cuve avec le couvercle et laisser l'éluant migrer par capillarité vers le haut de la plaque. La durée de la migration est d'environ une heure, mais peut varier en fonction du support et de l'éluant.
- Lorsque le front de l'éluant atteint environ 1 à 2 cm du bord supérieur de la plaque, retirer la plaque de la cuve et marquer immédiatement la position du front de l'éluant avec un crayon.
Séchage et Révélation
Sécher complètement la plaque à l'aide d'un sèche-cheveux, en prenant soin de ne pas la déchirer.
La plupart des acides aminés sont incolores et doivent être révélés. Plusieurs méthodes de révélation sont possibles :
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- Ninhydrine: Pulvériser la plaque avec une solution de ninhydrine (0,2 mg de ninhydrine dans 100 mL d'acétone). Chauffer légèrement la plaque pour faire apparaître les taches violettes caractéristiques des acides aminés.
- Iode: Placer la plaque dans une cuve contenant quelques cristaux d'iode et boucher la cuve. Les composés organiques apparaissent sous forme de taches jaune-marron.
- Lumière UV: Si la plaque est revêtue d'un indicateur fluorescent, les composés qui absorbent la lumière UV apparaissent comme des taches sombres sur un fond fluorescent lorsqu'ils sont exposés à une lampe UV.
Analyse des Résultats
Calcul du facteur de rétention (Rf): Le facteur de rétention (Rf) est le rapport de la distance parcourue par le composé à la distance parcourue par le front de l'éluant :
Rf = Distance parcourue par le composé / Distance parcourue par le front de l'éluantComparer les valeurs de Rf obtenues avec des valeurs de référence connues pour identifier les acides aminés présents dans l'échantillon. La valeur Rf est spécifique à chaque composé dans des conditions données.
Facteurs Influençant la Séparation
Plusieurs facteurs peuvent influencer la séparation des composés en CCM :
- Polarité de la phase stationnaire et de la phase mobile: La polarité relative de la phase stationnaire et de la phase mobile est un facteur critique. Les composés polaires ont tendance à mieux interagir avec les phases stationnaires polaires (par exemple, le gel de silice), tandis que les composés apolaires ont une plus grande affinité pour les phases mobiles apolaires.
- Nature de l'échantillon: Les propriétés chimiques des composés à séparer, telles que leur polarité, leur taille et leur charge, influencent leur comportement lors de la chromatographie.
- Température: La température peut affecter la solubilité des composés dans la phase mobile et leur adsorption sur la phase stationnaire.
- Humidité: L'humidité peut affecter l'activité de la phase stationnaire, en particulier pour les matériaux hygroscopiques comme le gel de silice.
Applications de la CCM
La CCM a de nombreuses applications dans divers domaines :
- Analyse qualitative: Identification des composés présents dans un mélange.
- Suivi de réactions chimiques: Surveillance de la progression d'une réaction en suivant la disparition des réactifs et l'apparition des produits.
- Contrôle de la pureté: Évaluation de la pureté d'un composé en détectant la présence d'impuretés.
- Séparation préparative: Isolement de petites quantités de composés pour une analyse ultérieure.
- Identification des acides aminés: Détermination de la composition en acides aminés d'un échantillon.
- Analyse des amines biogènes: Détection et quantification des amines biogènes dans les aliments et les boissons.
- Cartographie peptidique: Analyse de la composition peptidique d'une protéine après hydrolyse.
Séparation des Acides Aminés par CCM : Détails Spécifiques
La séparation des acides aminés par CCM nécessite une attention particulière en raison de leurs propriétés amphotères (présence de groupes amine et carboxyle). Les acides aminés peuvent exister sous différentes formes ionisées en fonction du pH de l'environnement, ce qui influence leur migration sur la plaque CCM.
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Procédure Étape par Étape pour la Séparation des Acides Aminés
- Préparation de la plaque TLC: Utiliser une plaque de CCM recouverte de gel de silice, car elle offre une surface polaire qui interagit bien avec les acides aminés.
- Application de l'échantillon: Dissoudre les acides aminés dans un solvant approprié et appliquer de petites taches de cette solution sur la plaque à l'aide d'un tube capillaire. Les taches doivent être petites (environ 1 mm de diamètre) et placées au-dessus de la ligne de base pour éviter tout contact direct avec le solvant dans la chambre de développement.
- Développement du chromatogramme: Verser le solvant sélectionné dans la chambre de développement sur une profondeur de quelques millimètres seulement, et laisser la chambre se saturer de la vapeur du solvant. Placer ensuite la plaque TLC dans la chambre, en veillant à ce que le niveau de solvant soit inférieur à la ligne de base. Fixer le couvercle pour empêcher l'évaporation.
- Exécuter la CCM: Laisser le solvant remonter la plaque par capillarité, entraînant avec lui les acides aminés. Le front du solvant doit être marqué immédiatement après avoir retiré la plaque de la chambre de développement.
- Séchage de la plaque: Après le développement, retirer la plaque de la chambre et la laisser sécher à l'air.
- Visualisation des acides aminés: Comme la plupart des acides aminés ne sont pas visibles à l'œil nu, des méthodes de révélation sont nécessaires. La ninhydrine est un réactif couramment utilisé. Après pulvérisation de la plaque avec une solution de ninhydrine, les acides aminés apparaissent sous forme de taches violettes après chauffage.
Analyse du Chromatogramme d'Acides Aminés
Mesure des distances: Mesurer la distance entre la ligne de base et le centre de chaque tache (distance de la tache), ainsi que la distance parcourue par le front du solvant à partir de la ligne de base (distance du front du solvant).
Calcul des valeurs Rf: Calculer le facteur de rétention (valeur Rf) pour chaque acide aminé à l'aide de la formule :
Rf = Distance de la tache / Distance du front du solvantComparaison avec les étalons: Comparer les valeurs Rf calculées avec celles d'étalons connus dans des conditions identiques pour identifier les acides aminés présents dans l'échantillon. La valeur Rf est unique pour chaque acide aminé dans des conditions spécifiques.
Exemple Pratique de Calcul des Valeurs Rf
Supposons un mélange d'acides aminés glycine, alanine et valine. Après avoir effectué une CCM et utilisé un spray de ninhydrine pour rendre les acides aminés visibles, on observe les taches à différentes distances de la ligne de base. Si le front du solvant a parcouru 6 cm et que les distances parcourues par les taches de glycine, d'alanine et de valine sont respectivement de 1,2 cm, 2,4 cm et 3 cm, leurs valeurs Rf seraient :
- Rf glycine = 1,2 cm / 6 cm = 0,20
- Rf alanine = 2,4 cm / 6 cm = 0,40
- Rf valine = 3 cm / 6 cm = 0,50
En comparant ces valeurs Rf à des valeurs standard, on peut identifier les taches qui correspondent à chaque acide aminé.
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CCM et Amines Biogènes
La CCM peut également être utilisée pour la détermination des amines biogènes (AB). Une méthode courante consiste à convertir les amines en dérivés de dansyl fluorescent, qui sont ensuite séparés sur des plaques de gel de silice et visualisés sous UV.
- Préparation des échantillons: Les amines sont extraites de l'échantillon (par exemple, milieu de culture bactérien) et dérivatisées avec du chlorure de dansyl pour les rendre fluorescentes.
- Séparation par CCM: Les dérivés de dansyl sont déposés sur une plaque de gel de silice et séparés par développement ascendant dans un solvant approprié (par exemple, chloroforme:triéthylamine 4:1).
- Visualisation et quantification: Les taches fluorescentes sont visualisées sous UV et quantifiées par densitométrie ou par comparaison avec des étalons.
Exemple d'Application : Identification de Composés Inconnus
Pour identifier des composés organiques inconnus dans un mélange, la CCM suit les principes de base : phase stationnaire, phase mobile et analyse des valeurs Rf. On applique une petite quantité du mélange inconnu et des composés de référence, on développe le chromatogramme et on compare les valeurs Rf. Les composés du mélange apparaissent sous forme de taches discrètes, et l'utilisation de lumière UV ou de réactifs de coloration peut être nécessaire pour visualiser les taches incolores.
Par exemple, si un mélange inconnu est suspecté de contenir de la caféine, de l'aspirine et du paracétamol, on effectue une CCM avec des échantillons connus de ces composés et on mesure les valeurs Rf. Si les valeurs Rf des composés inconnus sont similaires à celles des étalons, on peut identifier les composés du mélange inconnu.
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