La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique d'analyse couramment utilisée en chimie, trouvant son application pratique dans des domaines variés tels que la chimie, la biologie, la médecine, la pharmacie, l'analyse environnementale, la criminalistique, l'industrie alimentaire ou l'industrie chimique. Elle est largement employée dans les laboratoires pour la séparation et l'identification des composants d'un mélange. Cette méthode chromatographique repose sur le principe de migration différentielle des composés, en fonction de leur affinité pour deux phases : une phase stationnaire et une phase mobile. La CCM est utilisée pour vérifier la pureté des produits et de s'assurer de l'absence de contaminants, pour identifier les composants d'un mélange inconnu en les comparant à des composés de référence.
Principe de la Chromatographie sur Couche Mince
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire. La technique présentée ici est la chromatographie sur couche mince (CCM). Elle utilise une phase stationnaire déposée sur une plaque d'aluminium. La phase mobile est entraînée par capillarité vers le haut de la plaque.
Phases Stationnaire et Mobile
La phase stationnaire est généralement une fine couche d'adsorbant, comme la silice gelée, l'alumine ou la cellulose, déposée sur une plaque en verre, en plastique ou en aluminium. La phase mobile, quant à elle, est un solvant ou un mélange de solvants, appelé éluant, qui migre par capillarité à travers la couche stationnaire. Le choix de l'éluant est essentiel.
Matériel Nécessaire pour la CCM
Pour réaliser une CCM, plusieurs éléments sont indispensables :
- Plaques CCM : Elles constituent le support de la phase stationnaire.
- Cuve à chromatographie : Récipient clos contenant l'éluant et permettant le développement de la chromatographie. Elle doit être munie d'un couvercle pour saturer l'atmosphère en vapeurs d'éluant.
- Éluant : Solvant ou mélange de solvants utilisé comme phase mobile.
- Capillaires : Utilisés pour déposer les échantillons sur la plaque. Ils peuvent être fabriqués in situ avec un tube en verre.
- Lampe UV : Utilisée pour la révélation des composés absorbant dans l'ultraviolet.
- Révélateurs chimiques : Utilisés pour visualiser les composés incolores.
- Crayon : Pour tracer les lignes de dépôt et de front de solvant.
- Règle : Pour mesurer les distances et calculer les rapports frontaux (Rf).
- Plaque chauffante : Peut être utilisée pour chauffer légèrement les plaques après pulvérisation de révélateurs.
Plaques CCM : Choix du Support et de l'Absorbant
Le choix du support et de l'absorbant dépend de la nature des composés à séparer et des conditions expérimentales.
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- Support :
- Polyester : Recommandé pour les éluants à forte teneur en eau. Résiste à des températures de 160 °C et à tous les solvants.
- Aluminium : Peut être utilisé à des températures plus élevées que les feuilles de polyester. Déconseillé en présence d'éluants à forte proportion d'acides minéraux ou d'ammoniaque, solubilisant l'aluminium.
- Absorbant : Il en existe trois principaux : silice, alumine et cellulose.
- Silice : C'est le support le plus courant. Conseillé de toujours commencer par celui-là. Elle est utilisée en chromatographie en phase normale. Large domaine d'utilisation.
- Alumine : Possède un caractère basique.
- Cellulose : Utilisée pour la séparation des substances polaires, comme les sucres ou les acides aminés, en chromatographie de partage par interaction polaire.
- Indicateur fluorescent : Permet la détection des substances sous la lampe UV à 254 nm (sauf plaques polyester/cellulose sans indicateurs).
Technique de la CCM : Protocole Opératoire
La réalisation d'une CCM suit un protocole précis, garantissant des résultats optimaux.
- Préparation de la cuve : Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve. Il est important d'attendre un certain temps pour que l'atmosphère de la cuve soit saturée en vapeurs de solvant. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci.
- Préparation des échantillons : Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant. L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque.
- Préparation de la plaque : Tracer au crayon un trait à environ 1 cm du bas de la plaque (´ 5 cm), où seront déposées les taches. On trace un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes.
- Dépôt des échantillons : Déposer à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches. Chaque dépôt doit être réalisé avec soin.
- Développement de la chromatographie : Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. L'éluant va diffuser par capillarité à travers la phase stationnaire. La vitesse de migration de l'éluant dépend du support et de l'éluant.
- Arrêt et marquage du front de solvant : Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu. Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l'éluant.
- Séchage de la plaque : Laisser sécher la plaque à l'air libre ou à l'aide d'une plaque chauffante.
Révélation des Composés
La plupart des composés organiques sont incolores, il est donc nécessaire de les révéler pour les visualiser. Plusieurs méthodes de révélation existent :
- Observation sous UV : Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer au crayon les taches colorées ou fluorescentes. Détection des substances sous la lampe UV à 254 nm (sauf plaques polyester/cellulose sans indicateurs).
- Révélation à l'iode : Placer la plaque dans une cuve contenant quelques cristaux d'iode, puis boucher. Les composés organiques apparaissent sous forme de taches jaune-marron en présence d'iode.
- Révélateurs chimiques : Pulvériser la plaque avec un réactif spécifique qui réagit avec les composés à analyser, formant des taches colorées. Par exemple, la ninhydrine est utilisée pour révéler les acides aminés (taches noires), et le réactif de molybdène en présence de sulfate de cérium est utilisé pour révéler certains lipides. Il est important d'éviter toute formation de gouttelettes lors de la pulvérisation et d'appliquer le réactif en plusieurs pulvérisations légères.
Interprétation des Résultats : Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Le rapport frontal (Rf) est un paramètre caractéristique de chaque composé dans des conditions de CCM données. Il est défini comme le rapport de la distance parcourue par le composé sur la distance parcourue par l'éluant :
Rf = (Distance parcourue par le composé) / (Distance parcourue par l'éluant)
Le Rf est une constante pour un composé donné, dans un système de solvants et sur un support donnés. Il permet d'identifier les composés en comparant leurs Rf à ceux de composés de référence.
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Applications Avancées : CCM Bidimensionnelle
Dans certains cas, lorsque le mélange à séparer contient un grand nombre de composés, une CCM unidimensionnelle peut ne pas suffire à obtenir une séparation satisfaisante. On utilise alors la CCM bidimensionnelle.
- Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
- On laisse éluer dans un premier éluant.
- Après séchage, on fait tourner la plaque de 90° et on la place dans un second éluant. On obtient alors une cartographie de la protéine.
Cette technique permet d'améliorer la séparation des composés en exploitant deux phases mobiles différentes. Elle est particulièrement utile pour l'hydrolyse d'une protéine, ou lorsque l'on veut séparer un grand nombre de composés. La tache doit révéler le maximum d'information.
Facteurs Influençant la Séparation
Plusieurs facteurs peuvent influencer la séparation des composés en CCM :
- Polarité des composés : Les composés polaires ont tendance à interagir davantage avec la phase stationnaire polaire (silice, alumine, cellulose), tandis que les composés apolaires migrent plus rapidement avec la phase mobile.
- Polarité de l'éluant : Le choix de l'éluant est crucial. Un éluant polaire favorisera la migration des composés polaires, tandis qu'un éluant apolaire favorisera la migration des composés apolaires. Le choix dépend de la polarité des composés à séparer. Il est possible d'utiliser des mélanges d'éluants en proportions variées (100-0, 75-25, 50-50, 25-75, etc.) pour ajuster la polarité de la phase mobile.
- Interactions entre les composés et la phase stationnaire : Les interactions de type liaison hydrogène (donneur d'hydrogène (D), accepteur d'hydrogène (A), liaison hydrogènes) jouent un rôle décisif lors de la migration des composés. La liaison hydrogène influence la facilité à emmener les composés dans la phase mobile.
Avantages de la CCM
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) présente de nombreux avantages qui en font une technique d'analyse appréciée :
- Simplicité et rapidité : La CCM est une technique relativement simple à mettre en œuvre et ne requiert qu'un matériel peu encombrant. Ceci explique son emploi très fréquent dans les laboratoires. Nous avons vu que la technique de CCM est une technique fiable et rapide.
- Polyvalence : La CCM peut être utilisée pour analyser une large gamme de composés, organiques et inorganiques.
- Faible coût : La CCM est une technique relativement peu coûteuse à mettre en œuvre, ce qui la rend accessible à un large public.
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