Introduction
La thérapie génique, définie comme l'introduction délibérée de matériel génétique dans les cellules humaines, offre un potentiel immense pour corriger des défauts génétiques et traiter des maladies. Cet article explore les différentes stratégies de thérapie génique, leurs applications potentielles dans le traitement des maladies embryonnaires, et les considérations éthiques cruciales entourant cette technologie en évolution rapide.
Les Modalités de la Thérapie Génique
La thérapie génique peut être mise en œuvre selon diverses stratégies, en fonction du but recherché (complémentation ou réparation), du type de nucléotide transféré (ADN complémentaire, ADN génomique, oligonucléotide synthétique ou chimère d’ADN et d’ARN), du vecteur d’administration utilisé (viral ou non viral) et enfin du protocole clinique retenu (administration du transgène in vivo ou ex vivo dans des cellules préalablement prélevées et purifiées).
Techniques de Transfert de Gène
Pour faciliter la pénétration du transgène dans la cellule, on fait appel à des vecteurs viraux ou à d’autres méthodes. Le vecteur viral permet une meilleure efficacité du transfert et assure l’expression prolongée du gène transduit, tout au moins s’il est intégré dans le génome. Les inconvénients et risques, certains ayant un caractère théorique, sont la taille limitée de l’ADN transféré, les infections dues à la dissémination et à la réplication du virus ou même au nombre trop élevé de particules virales injectées, la possibilité de recombinaison du virus administré avec un virus sauvage, les réactions immunitaires vis-à-vis des protéines de l’enveloppe virale et la transformation maligne des cellules transduites.
Au contraire, les méthodes d’administration non virales éliminent tous les risques liés à l’injection d’un virus, permettent le transfert d’un segment d’ADN de grande taille et facilitent la production industrielle du médicament en supprimant toutes les étapes complexes relatives à la préparation et à la transformation du virus en un outil sans danger. La recherche d’un vecteur performant et sûr est toujours d’actualité malgré les nombreux progrès effectués. Le principe général de conception d’un vecteur viral est de déléter les régions du génome commandant la réplication du virus tout en maintenant son pouvoir infectant. Pour cela, les virus défectifs en gènes de structure sont introduits dans des cellules d’« empaquetage » ou de « complémentation » qui leur fournissent les protéines manquantes. Les particules virales libérées dans le milieu par ces cellules sont infectantes puisqu’elles possèdent les protéines permettant le démarrage du cycle viral, mais incapables de se reproduire puisqu’elles ne possèdent plus les régions indispensables du génome.
Vecteurs Viraux
Initialement les rétrovirus et les adénovirus furent seuls utilisés. Les rétrovirus dérivés habituellement d’onco-rétrovirus murins comme le virus de Moloney sont constitués d’un seul brin d’ARN. Ils ont été surtout utilisés ex vivo pour infecter les cellules de la moelle osseuse. Le virus s’intègre dans le génome des cellules en division. Le gène transféré se retrouve dans les cellules filles, ce qui explique la durée prolongée d’expression du transgène. Le virus ne se réplique pas diminuant fortement ainsi le risque de mutagenèse insertionnelle. L’efficacité du transfert est relativement faible. De ce fait, le succès repose sur l’acquisition par les cellules transduites d’un avantage sélectif de prolifération permettant ainsi la multiplication de ces cellules et donc la production d’une quantité suffisante de la protéine manquante.
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Les adénovirus sont constitués d’un double brin d’ADN. Ils appartiennent à une famille de virus très répandue responsable d’affections laryngopharyngées chez l’Homme. Ils peuvent infecter les cellules au repos avec un rendement élevé et ont surtout été utilisés in vivo. Leur expression est limitée dans le temps puisque le virus n’intègre pas le génome. En plus de réactions inflammatoires dont l’intensité augmente avec la quantité de virus injectée, l’introduction du virus déclenche également des réactions immunitaires qui sont à envisager sous un double aspect. D’une part, les anticorps préexistants provenant d’une exposition antérieure à un adénovirus sauvage de même sérotype et ceux produits à l’occasion de la nouvelle injection peuvent neutraliser les adénovirus et ainsi empêcher le transfert de gène. D’autre part, ces anticorps peuvent entraîner l’accumulation de lymphocytes T cytotoxiques au voisinage du point d’injection. Cette réponse immunitaire locale a été considérée comme bénéfique dans le traitement des tumeurs.
Les techniques de préparation des adénovirus se sont perfectionnées de manière à réduire leur caractère immunogène et le risque infectieux. Les virus des générations les plus récentes sont dépourvus de plusieurs régions du génome viral ou même de la totalité des gènes empêchant ainsi l’expression des protéines virales. Ils permettent une plus grande sécurité et une expression prolongée du transgène.
Plus récemment, on a utilisé des virus associés aux adénovirus (AAV) et des lentivirus. Les AAV sont des parvovirus sans pouvoir pathogène chez l’Homme. Ils peuvent infecter les cellules au repos avec une bonne efficacité et de manière persistante après intégration au génome et ne sont pas immunogènes. Leurs principaux inconvénients sont la limitation de la taille du gène pouvant être inséré et la difficulté de leur production industrielle. Les lentivirus sont des rétrovirus apparentés au virus de l’immunodéficience humaine (VIH) qui peuvent infecter des cellules au repos avec une grande efficacité.
Constructions Non Virales
Les constructions non virales sont faites d’ADN nu ou d’ADN complexé. L’ADN nu se présente sous forme de plasmides optimisés comme les minicercles ou les plasmides pCOR. Les plasmides pCOR (« conditional origin of replication ») ne peuvent se multiplier que dans une souche spécifique d’ Escherichia coli qui elle même ne pousse que dans un milieu spécial. Comme les minicercles, ils ne possèdent pas de gène marqueur de résistance aux antibiotiques. L’ADN complexé est uni à des molécules facilitant son transfert dans la cellule. Il peut s’agir de lipides cationiques solubles dans la membrane cellulaire et attirés par les charges négatives présentes à sa surface ou de polyéthylèneimine.
Applications Cliniques et Exemples de Succès
Les essais effectués ces dix dernières années ont montré qu’une des causes essentielles des échecs de la thérapie génique était la faible efficacité du transfert, la brièveté de l’expression du transgène et la difficulté, dans les maladies polygéniques, de définir le meilleur gène cible. Les indications logiques de ce traitement sont donc essentiellement les situations où ces problèmes peuvent être résolus : maladies héréditaires monogéniques avec déficit fonctionnel dont le gène muté responsable est connu, besoin limité en protéine manquante de sorte que la guérison est obtenue même lorsque la synthèse codée par le transgène est peu importante, cas où la population cellulaire transduite va acquérir un avantage sélectif par rapport aux autres cellules lui permettant de se multiplier.
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Traitement du Déficit Immunitaire Combiné Sévère (DICS)
L’exemple typique d’une réussite est le traitement du déficit immunitaire combiné sévère (DICS) de l’enfant par l’équipe du Pr. A. Fischer. Il s’agit d’une maladie liée à l’X, due à une mutation du gène de la sous-unité γ-C du récepteur de plusieurs cytokines, IL-2, 4, 7, 9 et 15. La voie de la thérapie génique paraissait justifiée, le traitement par allogreffe avec un donneur de la famille porteur d’antigènes HLA identiques n’étant pas toujours possible. Dans cet exemple, beaucoup de conditions théoriques de succès étaient réunies. L’expérience clinique montrait que les filles conductrices ne souffrent pas de déficit immunitaire, donc qu’un pourcentage réduit de précurseurs génétiquement normaux suffit. Tout ceci explique qu’un bénéfice clinique ait été obtenu avec la guérison des infections et le retour à une vie normale des enfants traités. Enfin, le gène γ-C est exprimé de manière constitutive. On n’a donc pas à craindre, comme dans d’autres déficits immunitaires, que l’expression anormale de la protéine dans les lymphocytes non activés consécutive à la transduction, conduise à l’apparition d’un lymphome malin.
Défis et Échecs
En contraste avec ce succès, de nombreux échecs sont survenus dans le traitement d’autres maladies héréditaires monogéniques. Dans la mucoviscidose, la faible longévité des cellules épithéliales bronchiques transduites avec le gène de la protéine CFTR et l’absence de récepteurs des adénovirus sur ces cellules, a rendu l’expression du transgène trop faible pour obtenir la guérison. Dans d’autres déficits immunitaires que le DICS, il n’y a pas ou peu d’avantage sélectif de prolifération des cellules transduites. C’est le cas des granulomatoses septiques chroniques, des déficits d’adhésion leucocytaire, du syndrome d’hyper IgM et du défaut d’expression des molécules d’histocompatibilité HLA de classe II. Enfin, avant de parler de succès, il faut avoir le recul nécessaire parce que l’expression de l’ADN codant le gène d’intérêt peut s’éteindre par méthylation du transgène. Cette extinction n’est pas prévisible et pose le problème du renouvellement du traitement.
Alternatives à l'Administration Répétée de Protéines
La thérapie génique représente une alternative avantageuse à l’administration répétée de protéines spécifiques, hormones, facteurs de croissance ou de coagulation, chaque fois que le produit synthétisé sous le contrôle du gène introduit est actif à faibles concentrations. L’avantage essentiel est, dans ce cas, une meilleure pharmacocinétique parce que la protéine est sécrétée de façon stable et prolongée après administration unique d’ADN. La suppression des pics de concentration liés à l’injection répétée de la protéine diminue le risque de désensibilisation des récepteurs. De plus, le coût d’un oligonucléotide de synthèse est bien inférieur à celui d’une protéine recombinante ou extraite, puis purifiée. Il faut, dans ce dernier cas, compter avec le risque de contamination virale que les techniques d’inactivation utilisées n’ont pas complètement supprimé.
Les inconvénients sont l’absence de contrôle physiologique de la sécrétion de la protéine pouvant conduire à des concentrations sanguines excessives et la nécessité de prévoir l’administration répétée du transgène, même si les intervalles à envisager sont toujours plus longs que pour la protéine. Ce dernier impératif rend préférable l’utilisation de vecteurs non viraux. Un exemple de maladie répondant à ces conditions est l’hémophilie de type A par mutation du gène du facteur VIII ou de type B par mutation du gène du facteur IX rendant insuffisantes leurs concentrations dans le plasma. la libération dans le plasma de ces deux facteurs ne nécessite pas l’expression de leurs gènes dans un organe déterminé, ce qui permet l’administration intramusculaire ou intrapéritonéale du transgène. Une publication récente a confirmé la validité de cette approche par les résultats obtenus chez six malades après injection dans le péritoine de fibroblastes autologues transduits in vitro avec le gène du facteur VIII. Le succès reste cependant relatif, la concentration de facteur VIII circulant atteinte ne dépassant pas 1 % de sa valeur normale.
Autres Applications
D’autres maladies sont ou ont été traitées au cours d’essais cliniques ou expérimentaux lorsqu’elles ont été considérées comme de bonnes candidates. C’est le cas du nanisme hypophysaire par défaut de sécrétion de l’hormone de croissance. Les techniques de vaccination habituellement utilisées pour la prévention des maladies infectieuses consistent à injecter pendant une période relativement courte une quantité minime d’antigène en un site corporel limité. Effectivement, un résultat positif a été obtenu chez les animaux d’expérience avec réponse humorale (apparition d’anticorps) et cellulaire (lymphocytes cytotoxiques).
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Le plus grand nombre des essais cliniques de thérapie génique ont eu pour but le traitement de tumeurs malignes. Une liste non exhaustive des cancers traités inclut le mélanome, le glioblastome, les cancers du poumon, du côlon, de l’ovaire, de la thyroïde, du foie, de la tête et du cou …. On est frappé d’emblée par la multitude des méthodologies et des gènes transduits montrant qu’aucun succès réel aboutissant à la guérison du patient avec un recul suffisant n’a été jusqu’à présent obtenu. Citons quelques exemples : la thérapie par utilisation d’un gène suicide utilise le gène de la thymidine kinase du virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV1-TK). Cette enzyme phosphoryle le ganciclovir le rendant fortement toxique pour les cellules en division. Dans ce système, des fibroblastes sont transduits et injectés dans la tumeur, le patient recevant du ganciclovir. Il se produit un effet de voisinage assurant la destruction des cellules tumorales non transduites proches du site de l’injection. L’efficacité de ce traitement paraît limitée à cause du faible rendement du transfert. La simple administration du ve…
Thérapie Génique Germinale et Édition du Génome : Le Potentiel de CRISPR-Cas9
La thérapie génique germinale, qui consiste à modifier un gène pour qu’il se transmette ensuite à la descendance, soulève des questions éthiques et juridiques importantes. L’intervention sur l’ADN des gamètes ou de l’embryon est réalisée en insérant, en corrigeant ou en retirant un petit segment d’ADN bien délimité (technique du CRISPR-Cas9). Cela entraîne une modification du génome de l’embryon ou du futur embryon, qui est potentiellement transmissible. À terme, le patrimoine génétique de l’espèce humaine pourrait être progressivement modifié.
La technologie CRISPR CAS9 permet, grâce à un complexe protéique et une séquence d’ARN dite « guide », de cibler une séquence d’ADN spécifique et de la découper. En effet, la thérapie génique vise à corriger les erreurs présentes dans notre code génétique, que ce soit pour réduire l’expression d’une protéine néfaste à l’organisme ou, à l’opposé, pour permettre l’expression d’une protéine essentielle à l’organisme. En cela, la technologie CRISPR/CAS 9 est toute trouvée. Par contre, comme pour toute thérapie génique, le problème de l’adressage, c’est-à-dire la capacité d’un traitement à n’atteindre que l’organe ou le tissu cible du médicament, se pose. L’équipe dirigée par le Dr Shoukhrat Mitalipov a décidé de s’affranchir du ciblage en travaillant directement sur des cellules embryonnaires. Ils ont travaillé sur un grand nombre d’embryons unicellulaires fécondés par des spermatozoïdes de pères atteints de pathologies héréditaires. En usant de la technique de CRISPR/CAS9, ils souhaitent montrer qu’il est possible d’obtenir des embryons viables de manière efficace et reproductible. Le choix d’un travail sur des cellules uniques est motivé par la réduction de l’effet dit « mosaïque » inhérent aux modifications génétiques réalisées sur des embryons en développement.
Expériences Récentes et Résultats Prometteurs
Après les publications de trois équipes Chinoises sur ce sujet, c’est au tour d’une équipe multinationale (Etats Unis, Corée du Sud, Chine) dirigée par Sukrat Mitalipov de présenter ses résultats début Août 2017. Dix huit heures après fertilisation (phase S de synthèse de l’ADN), les zygotes ont subit une micro-injection directe dans leur cytoplasme de la protéine Cas9, de deux ARN guides spécifiquement créés pour produire une cassure double brin de part et d'autre de la mutation MYBPC3GAGT sur l’allèle paternel, et pour certains d’entre eux d’un ADN de réparation exogène.
67% (36/54) des embryons étaient homogènes (tous les blastomères présentant le même génotype) et homozygotes pour l’allèle normal MYBPC3 (WT). Ici, ce ne sont plus les zygotes mais les gamètes (ovocytes) qui ont subit une micro-injection intra cytoplasmique du sperme du donneur (porteur de la mutation MYBPC3GAGT) et du système CRISPR/Cas9/ADN de réparation. 72% (42/58) des embryons étaient homogènes et homozygotes pour l’allèle MYBPC3 normal (WT). Ceci traduit un rendement de 22% au dessus du nombre attendu d’embryons homozygotes pour l’allèle MYBPC3 normal (qui est de 50%). Le rendement de réparation est supérieur lorsque le traitement CRISPR/Cas9 est effectué sur les ovocytes (22%) par rapport à ce qui est observé après traitement effectué sur les embryons en phase S (17%).
Les cassures double brin générées par Cas9 dans le génome du zygote et de l’ovocyte humains sont réparées par recombinaison inter-homologue avec l’allèle normal, c’est à dire l’allèle maternel utilisé comme matrice de réparation. Le fait que l’allèle muté puisse être efficacement réparé sans apparition de mosaïcisme est un élément important pour le futur de cette méthode dans le traitement des maladies génétiques monogéniques.
Défis et Risques Associés à CRISPR-Cas9
Enfin, il faut éviter absolument les effets “hors-cible” (off-target en anglais), c’est à dire éviter que CRISPR/Cas9 touche un autre locus génétique dans le génome qui aurait une séquence d’ADN voisine (homologue) de la séquence visée.
Considérations Éthiques et Juridiques
La thérapie génique, en particulier lorsqu'elle est appliquée aux embryons, soulève des questions éthiques fondamentales. La loi française de bioéthique, votée en 2011, affirme que « la création d’embryons transgéniques ou chimériques est interdite » et ce même dans le cadre de recherches fondamentales.
Atteinte au Patrimoine Génétique et Consentement
L’atteinte au patrimoine génétique héréditaire mise en œuvre sans consentement de l’intéressé est une critique souvent formulée. Modifier le génome d'un embryon, c'est intervenir sur le patrimoine génétique qui sera transmis aux générations futures, sans que les personnes concernées ne puissent donner leur consentement.
Risque d'Eugénisme
On redoute aussi l’eugénisme. Il faudrait mettre des guillemets, car la thérapie génique n’a rien à voir avec l’eugénisme politique, qui était coercitif et voulait empêcher les personnes dites dégénérées de procréer dans le but de préserver la santé de l’espèce humaine. Avec la thérapie génique, il s’agit simplement pour les parents d’avoir un enfant en bonne santé. Cette thérapie pourrait avoir des effets « eugéniques », en diminuant l’incidence de certaines maladies; mais faut-il s’en plaindre ?
Risques de Dérives et d'Amélioration Génétique
Certains craignent le passage de la thérapie à l’augmentation et voient poindre, à l’horizon, le transhumanisme. Certes, le génie génétique permettrait, en théorie, de s’y diriger, mais dans les faits, il n’y a pas de raison de le craindre si on place des barrières juridiques judicieuses.
Inquiétudes Scientifiques
Pour commencer, une modification du génome signifie une modification du patrimoine commun de l’humanité. Cela me gêne sur le plan philosophique. Mais aussi sur le plan scientifique, car une modification dans un gène peut mener à des effets secondaires non désirables à cause du phénomène de la pléiotropie (un gène peut déterminer plusieurs caractères phénotypiques, souvent encore inconnus). Le génome humain peut bien être découvert, mais non pas toutes les interactions génétiques, ni les régulations épigénétiques.
Nécessité d'une Régulation Internationale
La prudence appelle une régulation internationale des recherches et de leurs applications pour garantir notamment « le respect des personnes vulnérables et de l’intégrité personnelle », « la non-discrimination et la non-stigmatisation » ainsi que « la protection des générations futures ».
Biothérapies : Une Approche Plus Large
Parce que la pharmacologie classique n’offrait aucune perspective aux maladies génétiques rares longtemps considérées comme incurables, l’AFM-Téléthon impulse, depuis de nombreuses années notamment grâce aux dons du Téléthon, le développement de thérapies innovantes issues des connaissances récentes en génétique ou biologie cellulaire : les biothérapies. Une biothérapie est un traitement qui se base sur des médicaments biologiques, ou des médicaments biotechnologiques. Il en existe plusieurs sortes : La thérapie génique, qui consiste à réparer un gène défectueux ou à réintroduire un gène fonctionnel dans l’organisme. La thérapie cellulaire, qui consiste à injecter une cellule ou un patch cellulaire pour réparer les organes et restaurer une fonction. Ces stratégies thérapeutiques nouvelles ouvrent des perspectives pour traiter des maladies fréquentes.
Thérapie Cellulaire : Régénérer les Organes
La thérapie cellulaire consiste à greffer des cellules pour réparer ou régénérer un organe ou un tissu endommagé. La thérapie cellulaire repose sur trois types de cellules souches : Les cellules souches dites « adultes » sont des cellules capables de se régénérer, comme celles du foie, de la surface des intestins, des muscles… Elles participent au renouvellement de nos tissus. Elles peuvent être prélevées sur le patient, être cultivées puis réinjectées, sans risque de rejet. En revanche, elles ont une capacité de différenciation limitée et elles sont assez rares et difficiles à isoler et à cultiver. Les cellules souches dites « embryonnaires » se trouvent dans l’embryon lorsqu’il est au stade de quelques cellules. Faciles à cultiver et capables de proliférer à l’infini, elles peuvent se transformer en tout type de cellules spécialisées : de peau, de muscle, d’intestin, de veine… Les cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) permettent depuis 2007 à partir de cellules souches adultes de produire des cellules souches ayant les caractéristiques des cellules souches embryonnaires. De nombreux programmes de recherche leur sont consacrés.
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