Introduction
L'immunohistochimie (IHC) est une technique essentielle en biologie et en médecine, permettant de détecter et de localiser des protéines spécifiques dans des sections de tissus. Cette méthode repose sur l'utilisation d'anticorps marqués dirigés contre des épitopes de la protéine cible. Cet article explore en détail les matériels, les méthodes et les applications avancées de l'IHC, en mettant en lumière son importance dans le diagnostic des maladies et la recherche biomédicale.
Importance de la Préparation des Échantillons
La préparation de l'échantillon de tissu est une étape cruciale en IHC. Toute manipulation inappropriée peut altérer la structure du tissu, réduire l'affinité de liaison de l'anticorps, voire empêcher totalement la liaison. L'objectif principal est de préserver le tissu dans un état proche de ses conditions de vie réelle, tout en empêchant l'autolyse et la dégradation dues à la prolifération bactérienne ou fongique.
Fixateurs
Pour atteindre cet objectif, des fixateurs tels que le periodate lysine paraformaldéhyde (PLP) ou le formol sont couramment utilisés. Le formol, souvent utilisé à des concentrations de 4 % à 10 % (et jusqu'à 40 % dans certains cas), est dissous dans un tampon phosphate 0,1M pour stabiliser le pH. Bien que le formol offre une conservation morphologique supérieure, les échantillons fixés dans le formol et inclus dans la paraffine peuvent perdre une partie ou l'intégralité de leur immunoréactivité en raison de modifications structurelles de l'antigène ciblé.
Techniques de Récupération d'Épitopes
Pour améliorer la détermination des antigènes et, par conséquent, l'immunoréactivité, diverses techniques de récupération d'épitopes sont utilisées. On distingue principalement deux approches distinctes :
- Récupération d'Épitopes Induite par la Chaleur (HIER) : Cette méthode utilise une solution de récupération préchauffée, souvent constituée de TRIS hydrochloride (Tris-HCl) ou de citrate, avec une composition et un pH variables. Les échantillons sont exposés à la chaleur pendant une durée variable (généralement entre 10 et 60 minutes), avant d'être doucement refroidis. La chaleur peut être générée par autoclave, bain-marie, autocuiseur ou tout appareil similaire.
- Récupération d'Épitopes Induite par la Protéolyse (PIER) : Cette méthode utilise des enzymes digestives, telles que la protéinase K, la trypsine, la pepsine et diverses autres protéinases. La durée d'incubation et les concentrations optimales doivent être testées pour optimiser les spécificités de l'échantillon.
Méthodes de Marquage Immunohistochimique
Plusieurs méthodes de marquage sont utilisées en IHC, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients.
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Méthode Directe
Dans cette méthode, un anticorps marqué (avec un substrat chromogène par exemple) réagit directement avec l'antigène présent dans le tissu. L'avantage de cette méthode réside dans le fait qu'un seul anticorps est nécessaire, ce qui rend l'application rapide et génère peu de liaisons non spécifiques. Cependant, puisque un seul anticorps se lie à un épitope, l'intensité du signal est faible.
Méthode Indirecte
La méthode indirecte a été mise au point pour palier au problème de la faible intensité du signal de la méthode directe. L'anticorps primaire se lie à l'antigène, puis un anticorps secondaire (marqué) se lie à l'anticorps primaire. Le signal est amplifié du fait que plusieurs anticorps secondaires sont liés à un anticorps primaire unique. Un avantage de cette méthode est qu'un seul anticorps marqué est nécessaire pour différentes substances cibles, ce qui permet de réduire les coûts. Son inconvénient est que les liaisons non spécifiques sont plus fréquentes qu'avec la méthode directe. Pour amplifier davantage le signal, il est possible d'utiliser un anticorps supplémentaire qui vient se lier à l'anticorps secondaire, entraînant une troisième couche d'anticorps, tous marqués. Cette méthode peut être utile pour colorer les antigènes ayant un nombre d'épitopes limité.
Méthode PAP (Peroxydase Anti-Peroxydase)
Bien que moins utilisée aujourd'hui, la méthode peroxydase anti-peroxydase était autrefois populaire dans les laboratoires de pathologie. Il s'agit d'une méthode indirecte qui se base sur une troisième couche d'anticorps, liés à la peroxydase, venant se lier à un anticorps de la deuxième couche non conjugué. La peroxydase n'est pas conjuguée chimiquement à l'IgG, mais est liée immunologiquement. Cela signifie que l'anticorps de la troisième couche est spécifique à la peroxydase, augmentant ainsi l'activité de la peroxydase et la sensibilité du dosage.
Méthodes du Complexe (Strept)avidine-Biotine (ABC)
De nos jours, l'une des méthodes les plus couramment employées pour la coloration se fonde sur l'affinité élevée de l'avidine (œuf de poulet) et la streptavidine (Streptomyces avidinii) vis-à-vis de la biotine. Le principe de base est que l'avidine (ou la streptavidine) réagit avec un anticorps secondaire biotynilé, ce qui s'ensuit d'une réaction à la peroxydase de raifort. Dans certains cas, l'amplification catalysée du signal est utilisée, où un réactif d'amplification entraîne l'agrégation d'un grand nombre de biotines qui vont ensuite réagir avec la peroxydase marquée à la streptavidine. La streptavidine est souvent préférée à l'avidine en raison de sa moindre liaison électrostatique, ce qui réduit le signal de fond.
Méthodes Polymériques
Les méthodes polymériques utilisent de grands polymères liés à l'anticorps, capables de se lier à un grand nombre de molécules (en général, environ dix anticorps pour 70 enzymes). Cette configuration permet d'amplifier considérablement le signal, d'obtenir une sensibilité accrue, de réduire les liaisons non spécifiques et de diminuer le signal de fond.
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IHC Multiplex et Technologies Avancées
L’immunohistochimie en multiplex est une technique plus récente qui permet de réaliser de multiples immunomarquages séquentiellement et donc d’étudier de nombreux co-marquages. Des technologies avancées telles que RNAscope, GeoMx DSP, Visium et Xenium offrent des perspectives nouvelles pour l'analyse spatiale des tissus.
RNAscope
RNAscope est une méthode d’hybridation in situ utilisant des paires de sondes en Z contenant une séquence complémentaire de 18 à 25 nucléotides à l’ARN cible et une séquence complémentaire à l’amplificateur. Les deux sondes de chaque paire doivent s’hybrider indépendamment à leurs séquences cibles respectives. Les amplificateurs se lient ensuite sur la paire de sondes.
GeoMx DSP
La technologie GeoMx DSP est une technologie de transcriptomique et protéomique spatiale basée sur le séquençage nouvelle génération. Elle permet d’étudier plus de 20 000 ARN et 150 protéines. Elle est adaptée aux divers tissus (congelé ou paraffine). Les ARN ou protéines d’intérêts sont détectés par des sondes ou des anticorps couplés à une molécule photoclivable avec un code-barre spatial permettant ainsi de les localiser dans le tissu. Des marqueurs morphologiques (IBA-1, GFAP, Olig2, CD3, PanCK…) permettent de sélectionner des populations cellulaires ou des régions d’intérêt dans le tissu. La lame histologique est imagée sur la plateforme GeoMx DSP. À l’aide de marqueurs morphologiques, les régions d’intérêt sur la coupe de tissu sont sélectionnés puis illuminées par la lumière UV afin de cliver les oligonucléotides contenant les code-barres spatiaux. Ces oligonucléotides sont aspirés et collectés dans une plaque à 96 puits. Ils sont ensuite amplifiés et séquencés sur une plateforme illumina.
Visium
Visium V1 utilise une lame contenant des spots recouverts de poly(dT), permettant ainsi de capturer l’ensemble des ARNm du tissu. Une coloration HE ou une immunofluorescence est réalisée au préalable afin d’obtenir des informations morphologiques du tissu. Le tissu est ensuite perméabilisé pour libérer les ARNm qui seront capturés par des poly(dT). Les ARNm capturés sont rétro-transcrits en ADNc, puis amplifiés et séquencés sur une plateforme Illumina. Les données de séquençage et l’image histologique sont alignées dans le logiciel SpaceRanger de 10X Genomics permettant ainsi de cartographier les profils d’expression génique sur la coupe de tissu. La version V2 de Visium améliore la sensibilité et la qualité des données transcriptomiques par rapport à la version V1. La technologie utilise une lame de 2 zones de capture de 6,5 x 6,5 mm ou 11 x 11 mm, optimisés pour capturer davantage d’ARNm et augmenter le nombre de gènes détectés par spot. La zone de capture présente respectivement environ 5000 ou 14000 spots barcodés de 55 µm chacun. Les informations morphologiques du tissu (coloration HE ou immunofluorescence) sont obtenues sur une lame histologique standard. L’hybridation est ensuite réalisée à l’aide d’un panel de sondes (humaines ou murines). Une ligase est ajoutée après l’hybridation afin de créer une jonction entre les sondes hybridées à l’ARN. La lame Visium HD présente 2 zones de capture de 6,5 x 6,5 mm avec des spots de 2µm . Cela permet de cartographier l’expression génique avec une finesse accrue et de mieux distinguer les cellules voisines. Le protocole Visium HD suit des étapes similaires à la version V2, avec une étape impliquant l’utilisation du CytAssist pour le relâche et la capture des produits de ligation.
Xenium
Xenium de 10x Genomics est une technologie avancée de transcriptomique spatiale basée sur l’imagerie et l’hybridation in situ séquentielle. Xenium permet l’analyse simultanée de l’expression de centaines d’ARNs sur des sections tissulaires. Cette technologie permet d’étudier et localiser des ARNs d’intérêt avec précision grâce à sa résolution spatiale subcellulaire. Le tissu est d’abord perméabilisé afin de libérer des ARNs d’intérêt. Ces derniers sont ensuite détectés par hybridation in situ avec des sondes complémentaires. Des étapes de ligation et d’amplification des sondes hybridés sont ensuite réalisées pour augmenter le signal fluorescent, facilitant ainsi la détection précise des transcrits.
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Applications Médicales de l'Immunohistochimie
L'immunohistochimie joue un rôle crucial dans divers aspects de la médecine, notamment en pathologie, en recherche biomédicale et dans le développement de thérapies ciblées.
Rôle en Pathologie
L'IHC permet l'identification de cellules anormales dans les biopsies, facilitant ainsi le diagnostic des maladies. Elle est essentielle pour découvrir la fonction et la distribution des protéines dans les maladies et est utilisée pour sélectionner des patients susceptibles de bénéficier de thérapies spécifiques. L'IHC est souvent un partenaire des techniques de biologie moléculaire pour valider les résultats obtenus à partir d'analyses génétiques.
Immunohistochimie et Cancer
Dans le domaine du cancer, l'immunohistochimie (IHC) est utilisée pour analyser la distribution et l'expression de marqueurs spécifiques dans les tissus tumoraux. Voici quelques-unes des représentations importantes de l'utilisation de l'IHC en oncologie :
- Diagnostic : Identification de types cellulaires spécifiques et de pathologies oncologiques.
- Pronostic : Évaluation des marqueurs de prolifération cellulaire, tels que Ki-67, qui aident à déterminer l'agressivité du cancer.
- Thérapies ciblées : Détection de protéines comme HER2 pour envisager des traitements dirigés.
Cette technique permet de déterminer le statut des récepteurs hormonaux dans des cancers tels que le cancer du sein, guidant ainsi les décisions thérapeutiques. Un exemple pratique de l'application de l'IHC est la détection de HER2 dans le cancer du sein, où des anticorps couplés à des enzymes détectent des antigènes dans les tissus, produisant une réaction colorée visible au microscope optique.
Méthodologie Immunohistochimique Détaillée
Pour mener une analyse immunohistochimique efficace, plusieurs étapes clés doivent être suivies.
Étapes de la Méthodologie
- Fixation : Préserver les tissus en maintenant leur structure et les antigènes. Des fixateurs comme le formaldéhyde contribuent à la préservation des antigènes pour une détection précise.
- Inclusion en paraffine : Permettre la coupe en sections minces des tissus.
- Déparaffinage et réhydratation : Préparer les sections pour le marquage en éliminant la paraffine.
- Blocage des sites non-spécifiques : Utiliser des sérums ou d'autres solutions pour éviter les liaisons non spécifiques d'anticorps.
- Application de l'anticorps primaire : Lier directement ou indirectement à l'antigène d'intérêt. La dilution de l’anticorps primaire est à définir selon sa concentration afin d’obtenir une concentration finale d’environ 1 µg/ml. L’incubation de l’anticorps primaire peut se faire à température ambiante pendant 1h ou sur la nuit à 4°C. Le choix du diluent est important, certains sont plus bloquants que d’autres.
- Incubation avec l'anticorps secondaire : Conjugué à un enzyme ou fluorophore pour visualisation.
- Révélation : Utilisation d'un substrat chromogène pour obtenir une coloration visible.
- Contre-coloration : Ajouter une teinture pour contraste et meilleure visualisation.
Outils et Techniques Essentiels
- Microscope à fluorescence : Pour visualiser les échantillons marqués par fluorescence.
- Bains histologiques : Utilisés pour chauffer, déparaffiner et réhydrater les échantillons.
- Hotte à flux laminaire : Maintient un environnement stérile lors de la manipulation des réactifs.
Optimisation des Marquages Problématiques
Si des marquages problématiques sont observés, plusieurs axes d’amélioration peuvent être explorés :
- Démasquage :
- Par la chaleur (HIER) : Utilisation de tampons citrate (pH 6,0), EDTA (pH 8,0) ou Tris-EDTA (pH 9,0). Le temps de démasquage varie selon le pH et l’antigène, avec des méthodes comme l'autocuiseur (15-30 min à 120°C) ou le bain-marie (20-60 min à 95-98°C).
- Enzymatique (PIER) : Utilisation d'enzymes comme la pepsine, la pronase, la trypsine, la protéinase K ou la ficine. L’incubation est de 10 à 20 min à 37°C en fonction de l’antigène et du tissu.
- Tampons de lavage : Les lavages se font généralement en tampon PBS avec 0,2% de tween ; si vous avez un peu de bruit de fond n’hésitez pas à augmenter le pourcentage de tween ou à passer en tampon TBS.
- Tampons de blocage : Utilisation de tampons à base de BSA, SmartBlockTM (peptides synthétiques), The Blocking SolutionTM (caséine) ou sérum normal d’animaux. Le SmartBlock semble mieux pénétrer dans les tissus et ainsi permettre le blocage de plus de sites non spécifiques.
Exemples Spécifiques
- Lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL) : Caractérisé par des cellules grandes et pléomorphes exprimant fréquemment l'antigène CD30 et l'antigène de membrane épithéliale (EMA).
- Alpha-foetoprotéine (AFP) : Un antigène onco-fœtal de 70 kDa détectable dans les liquides biologiques.
- Racémase Alpha-méthylacyl-CoA (AMACR) : Également appelée p504s, est une enzyme mitochondriale et péroxysomiale impliquée dans la biosynthèse des acides biliaires et la bêta-oxydation des acides gras à chaîne ramifiée.
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