Introduction
Dans le domaine en constante évolution du diagnostic génétique, le séquençage d'ARN (RNA-seq) émerge comme un outil puissant et complémentaire aux méthodes de séquençage génomique traditionnelles. Cette technologie innovante permet d'identifier les anomalies d'expression, d'épissage ou d'expression monoallélique, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour le diagnostic des maladies rares. Les maladies neuromusculaires, les maladies mitochondriales et les maladies héréditaires du métabolisme, caractérisées par leur hétérogénéité génétique et clinique, bénéficient particulièrement de cette approche. Cet article explore les différentes applications du RNA-seq dans le diagnostic de ces maladies complexes, en mettant en évidence les avantages, les défis et les perspectives d'avenir de cette technologie prometteuse.
RNA-seq et maladies neuromusculaires : élucider les énigmes diagnostiques
Les maladies neuromusculaires se distinguent par leur diversité génétique et clinique, ce qui rend le diagnostic moléculaire particulièrement difficile. Malgré les avancées du séquençage du génome, une proportion significative de patients (30 à 60 %) reste sans diagnostic. L'analyse transcriptomique par RNA-seq offre une solution potentielle en révélant les anomalies d'épissage liées à des variants non détectés ou initialement classés comme variants de signification incertaine (VSI).
Optimisation de la stratégie de séquençage du transcriptome
L'équipe du Laboratoire de Génétique Moléculaire, APHM, a entrepris une évaluation rigoureuse de différentes approches techniques et bioinformatiques pour intégrer l'ARNseq dans leur processus diagnostique. Une comparaison entre l'ARNseq total (ribodéplétion) et l'ARNseq polyA a révélé que l'approche polyA offre une couverture supérieure pour certains gènes, tels que MTM1, et comparable pour d'autres, comme CAPN3. Cependant, la couverture des grands gènes, tels que TTN, était moins uniforme avec l'approche ARNseq-polyA, avec des régions peu couvertes. Par exemple, un variant pathogène affectant l'épissage du gène TTN n'a été que faiblement détecté avec l'approche ARNseq-polyA, contrairement à l'approche ARNseq total. Ces résultats soulignent l'importance de choisir la stratégie de séquençage du transcriptome en fonction du gène suspecté cliniquement ou du variant candidat.
Évaluation de la performance de l'ARNseq total
Dans le cadre du projet APHM Starter ARNseq-Musc, l'approche ARNseq total a été évaluée sur 50 biopsies musculaires de patients en errance diagnostique. Bien que les inclusions soient toujours en cours, un diagnostic a déjà pu être posé chez 9 patients. Dans certains cas, le variant candidat a entraîné plusieurs anomalies d'épissage, rendant l'analyse ciblée par RT-PCR difficilement envisageable. Au-delà de cette phase pilote, des résultats préliminaires montrent que l'approche ARNseq basée sur la capture exome permet d'obtenir une couverture très satisfaisante des gènes musculaires, tout en facilitant l'intégration de l'analyse transcriptomique dans le workflow de séquençage d'exome déjà en place dans le laboratoire.
Analyse ARNseq sur lymphocytes cultivés
L'analyse ARNseq a également été mise en place sur des lymphocytes cultivés, ce qui a permis dans plusieurs cas d'explorer l'effet du variant sur l'épissage sans recourir à une biopsie musculaire. Cette approche moins invasive offre une alternative intéressante pour l'étude des variants d'épissage dans les maladies neuromusculaires.
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RNA-seq et maladies mitochondriales : améliorer le rendement diagnostique
Les maladies mitochondriales, un autre groupe de pathologies génétiques rares et hétérogènes, présentent également des défis diagnostiques importants. Malgré le séquençage d'exome, voire de génome, près de la moitié des patients restent sans diagnostic moléculaire. Le RNA-seq se présente comme un outil prometteur pour améliorer le rendement diagnostique, notamment par l'étude de l'expression et de l'épissage des gènes.
Évaluation de la faisabilité de combiner RNA-seq et séquençage d'exome
Une étude a évalué la faisabilité de combiner le RNA-seq au séquençage de l'exome à travers deux stratégies : une approche ciblée, chez huit patients porteurs de VSI ou d'un seul variant pathogène dans des gènes candidats récessifs, et une approche non ciblée, chez 30 patients sans gène candidat, centrée sur la détection d'anomalies d'expression. L'approche ciblée a permis d'identifier des phénotypes aberrants d'ARN associés à sept variants, confirmant leur pathogénicité et conduisant à un diagnostic moléculaire définitif chez cinq patients (62.5%). La combinaison du RNA-seq avec le séquençage du génome a permis un diagnostic chez deux patients supplémentaires. Ces résultats ont été obtenus grâce à la mise en évidence d'une expression mono-allélique pour cinq variants et d'un épissage aberrant pour six variants, dont deux n'ont pu être significativement détectés qu'après un traitement à la puromycine.
Identification de gènes sous-exprimés
Concernant l'approche non ciblée, l'utilisation de l'outil Outrider et d'une approche dédiée aux gènes mitochondriaux a permis d'identifier trois gènes sous-exprimés chez trois patients présentant un tableau clinique compatible (10%). Une réanalyse de l'exome, voire une étude du génome, est en cours afin d'interpréter ces résultats. Cette étude met en évidence la valeur ajoutée du RNA-seq dans le diagnostic des maladies mitochondriales chez des patients restés sans diagnostic après séquençage d'exome, en apportant des preuves fonctionnelles solides pour reclasser plusieurs VSI et en identifiant de nouveaux gènes candidats chez des patients sans orientation diagnostique initiale.
Perspectives d'amélioration
Bien que très prometteurs, ces résultats pourraient vraisemblablement être encore améliorés grâce à l'augmentation de la taille de la cohorte, de la profondeur de séquençage et au recours à des outils bio-informatiques complémentaires capables de détecter des phénotypes aberrants d'ARN différents.
RNA-seq et variants d'épissage : une meilleure interprétation clinique
Malgré les progrès des algorithmes de prédiction in silico, l'impact fonctionnel de nombreux variants susceptibles d'altérer l'épissage reste incertain, limitant leur interprétation clinique selon les critères ACMG. Dans le cadre de l'évolution des techniques de diagnostic génétique, l'intégration du séquençage d'ARN permet une meilleure compréhension des variants d'épissage.
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Reclassification des VSI
Une cohorte de 102 familles adressées à un laboratoire après un génome ou un exome non contributifs a été étudiée. L'indication la plus fréquente était un trouble du neurodéveloppement avec ou sans déficience intellectuelle (88 %). 60 % des familles avaient au moins un VSI dans un gène d'intérêt prédit pour avoir un effet sur l'épissage. L'analyse ciblée a permis de reclasser 43 VSI (69 %), dont 23 en classe 4/5 (pathogène/probablement pathogène) et 20 en classe 2 (probablement bénin). La concordance avec les algorithmes de prédictions in silico était partielle.
Analyse en aveugle
L'analyse en aveugle chez 79 patients a permis de prioriser des régions du génome chez 5 patients, et a conduit à un diagnostic chez 3/79 patients (3.8%). Dans 2 cas, il s'agissait de variants de structure complexe, non détectés par exome ou génome et dans 1 cas, d'un variant ponctuel hétérozygote. Le séquençage d'ARN s'avère particulièrement utile en cas de VSI prédits pour affecter l'épissage, permettant d'aboutir à un diagnostic dans 37 % des cas (23/62). En analyse en aveugle, bien que son rendement reste plus faible (3/79, soit 3.8 %), il a permis de mettre en évidence des variants non détectés par les approches conventionnelles.
RNA-seq et maladies héréditaires du métabolisme : confirmer l'effet délétère des variants
Les maladies héréditaires du métabolisme sont un groupe de maladies génétiques rares qui touchent la fonction d'une enzyme ou transporteur impliqués dans l'homéostasie cellulaire. Le diagnostic génétique de ces maladies, orienté préalablement par le bilan biochimique, est essentiel pour la mise en place d'un traitement et la prévention des décompensations aiguës. Cependant, pour ces maladies parfois extrêmement rares, il n'y a souvent que peu de mutations rapportées dans la littérature et des variants convaincants, en adéquation avec le phénotype clinique et biochimique, sont classés comme VUS.
Approches basées sur l'étude des transcrits
Plusieurs approches basées sur des études de transcrits à partir d'ARNm extraits de sang ou fibroblastes chez des patients atteints d'un déficit du métabolisme pour lesquels le séquençage de l'ADNg en première intention a conduit à l'identification d'un VUS ont été proposées. Le séquençage RNAseq est une technique de choix pour les gènes exprimés dans ces tissus. Par cette approche, il a été possible de confirmer l'effet délétère du variant c.1091-2075T>G du gène PCCB qui est responsable de la rétention d'un fragment intronique de plus de 100nt, et du variant c.-14+1G>A du gène CPT1A qui crée un nouvel exon 1 non traduit alternatif.
RT-PCR et PCR nichée
Pour les gènes peu exprimés dans les tissus accessibles, comme le gène OTC dans le déficit en OTC, la technique de RT-PCR, avec une ré-amplification de la région cible du transcrit par une PCR nichée, peut être utilisée. Par cette technique, il a été possible de démontrer l'effet délétère du variant c.-142G>A du gène OTC qui entraine un défaut de la transcription, ainsi que de la large duplication des exons 1 à 4 du gène OTC qui sont en tandem avec rétention d'un fragment du promoteur.
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Minigene assay
Dans certains cas, les analyses à partir des tissus du patient ne permettent pas d'apporter les arguments nécessaires pour confirmer le caractère délétère d'un variant. L'analyse du variant cible par minigene assay peut alors être proposée.
RNA-seq et neurofibromatose de type 1 : confirmer le diagnostic
La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie génétique de transmission autosomique dominante causée par des variants perte-de-fonction du gène NF1. L'analyse moléculaire initiale en panel NGS et en MLPA peut mettre en évidence des altérations telles que des duplications d'exons. L'analyse moléculaire du génome peut révéler des duplications inversées en tandem associées à des duplications simples directes d'une partie d'introns. La combinaison de différents outils moléculaires permet de confirmer le diagnostic de NF1 et de rendre possible un conseil génétique optimal.
SOSTAR et MAGIC : outils pour l'analyse des isoformes d'ARNm
La caractérisation précise des isoformes d'ARNm demeure un enjeu majeur en recherche et en diagnostic moléculaire. Les méthodes actuelles peinent à fournir une annotation standardisée et exhaustive des transcrits. SOSTAR et MAGIC sont des outils développés pour l'analyse des isoformes d'ARNm. SOSTAR a été validé sur une cohorte de patients présentant une suspicion de prédisposition héréditaire aux cancers du sein et de l'ovaire. MAGIC est une extension de SOSTAR conçue pour l'analyse de constructions artificielles issues de minigènes multi-exoniques. L'analyse des données avec le pipeline MAGIC permet d'annoter les isoformes générées à partir de ces constructions artificielles.
RAINBOW : simplifier l'interprétation des données RNA-seq
L'interprétation des données générées par le séquençage d'ARN (RNAseq) peut être complexe et chronophage. RAINBOW est un outil bioinformatique qui vise à transformer les sorties brutes de DROP en résultats cliniquement exploitables. RAINBOW prend en entrée l'intégralité des tables générées par DROP pour les modules OUTRIDER, FRASER et MAE, qui sont ensuite filtrées par une série de critères définis de façon empirique. L'outil intègre également les informations phénotypiques de chaque individu afin de mettre en évidence des candidats compatibles avec le tableau clinique. RAINBOW offre un environnement reproductible et personnalisable pour réduire le temps nécessaire à l'interprétation et à mieux exploiter le potentiel diagnostique du RNAseq.
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