Introduction
Le tournesol (Helianthus annuus) est une culture oléagineuse importante dans le monde entier. L'amélioration de cette culture est un processus continu visant à augmenter le rendement, la résistance aux maladies et la tolérance aux stress abiotiques. Parmi les nombreuses techniques utilisées pour l'amélioration du tournesol, la culture d'embryons immatures occupe une place importante. Cet article explore les différentes facettes du développement des embryons immatures de tournesol, en mettant l'accent sur les techniques de culture in vitro, leurs applications dans l'amélioration des plantes et les avancées récentes dans ce domaine.
Culture in vitro d'embryons immatures de tournesol
Technique de base
La culture in vitro d'embryons immatures est une technique qui consiste à prélever des embryons de tournesol à un stade précoce de développement, quelques jours après la fécondation, et à les cultiver dans un environnement stérile sur un milieu nutritif artificiel. Cette technique permet de contourner la phase de maturation de la graine et d'accélérer le cycle de reproduction du tournesol, permettant ainsi de réaliser plusieurs générations par an.
La technique de culture d'embryons immatures est réalisée in vitro. Elle permet d’éviter la phase de maturation de la graine. En effet, par cette technique, les embryons sont prélevés quelques jours après la fécondation et non à maturité de la graine et cela permet ainsi de réaliser plusieurs générations par an. Selon les espèces, les embryons sont prélevés plus ou moins tôt après la fécondation. En effet, un très jeune embryon risque d’avoir une croissance perturbée et plus lente, contrairement à un embryon plus développé qui est par ailleurs plus facile à prélever. Les embryons sont ensuite mis en culture pour régénérer une plante entière. La culture in vitro d’embryons permet de réduire fortement la dormance des graines fraîchement récoltées, et ainsi d’assurer un développement homogène des embryons. Cette technique permet donc un gain de temps, par réduction de la durée entre deux générations. On peut cultiver plusieurs générations par an et accélérer les procédures classiques de sélection : la fixation et la conversion de lignées, car plusieurs cycles d’autofécondations ou de rétrocroisements successifs peuvent être réalisés chaque année. Cette technique est très utilisée chez le tournesol et dans une moindre mesure chez le maïs.
Protocole simplifié pour le tournesol
Une technique simplifiée de sauvetage d’embryons de tournesol a également été mise au point. Toutes les étapes de l’extraction des graines du capitule jusqu’au repiquage sur terreau sont réalisées en conditions non stériles.
Étapes clés de la culture in vitro
- Prélèvement des embryons : Les jeunes graines sont prélevées 8 à 15 jours après la fécondation, selon le génotype.
- Désinfection : Les graines sont désinfectées pour éliminer les contaminants.
- Dissection : Les embryons sont isolés des graines sous conditions stériles.
- Culture : Les embryons sont placés en culture dans des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif approprié.
- Développement : Au bout de 3 à 5 jours, on observe la formation de cotylédons chlorophylliens.
- Enracinement : Les embryons sont transférés en milieu d'enracinement jusqu'à l'apparition d'un système racinaire développé.
- Acclimatation et repiquage : Les plantules sont acclimatées puis repiquées dans du terreau.
Applications de la culture d'embryons immatures dans l'amélioration du tournesol
La culture d'embryons immatures offre de nombreuses applications pour l'amélioration du tournesol, notamment :
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Accélération de la sélection
La technique de culture d’embryons immatures est très pratiquée chez le tournesol où les phénomènes de dormance des graines sont particulièrement intense. Elle est très facile à mettre en œuvre, et permet d’obtenir 4 à 5 générations successives par an, au lieu d’une seule en culture normale, car le cycle végétatif est ramené à 80 jours. Elle est utilisée pour réaliser la fixation de lignées, la reconversion de lignées mâles fertiles en mâles stériles, ou l’introduction de gènes de résistance.
La culture in vitro d'embryons permet de réduire fortement la dormance des graines fraîchement récoltées, et ainsi d’assurer un développement homogène des embryons. Cette technique permet donc un gain de temps, par réduction de la durée entre deux générations. On peut cultiver plusieurs générations par an et accélérer les procédures classiques de sélection : la fixation et la conversion de lignées, car plusieurs cycles d’autofécondations ou de rétrocroisements successifs peuvent être réalisés chaque année.
La culture d'embryons immatures permet de réduire la durée du cycle de sélection en évitant la dormance des graines et en permettant de réaliser plusieurs générations par an. Ceci accélère la fixation de lignées et la conversion de lignées mâles fertiles en mâles stériles.
Création de variabilité génétique
Pour accroître la variabilité génétique, et introduire par exemple des gènes de résistance aux maladies, le sélectionneur fait souvent appel aux croisements interspécifiques. Le croisement de plantes éloignées génétiquement peut se révéler délicat. Le sauvetage d’embryons immatures in vitro permet d’obtenir une descendance viable. Cette technique est également utilisée après des croisements intra-spécifiques, lorsqu’il existe des obstacles physiologiques à la survie de la graine.
La culture d'embryons immatures est utilisée pour surmonter les barrières d'incompatibilité lors de croisements interspécifiques, permettant ainsi d'introduire de nouveaux gènes dans le tournesol cultivé.
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Sélection assistée par culture in vitro
Ce travail fait état de deux applications concrètes de la culture d'embryons immatures à l'amélioration du tournesol, l'objectif sous-jacent étant d'évaluer la variabilité génétique du matériel sur lequel ont été appliquées ces techniques. 1-L'une permet de créer des contraintes hydriques durant la culture ''in vitro'' au stade juvénile (embryon ou plantule), afin de sélectionner le matériel plus résistant au déficit hydrique. 2-L'autre se réfère à la culture ''in vitro'' des embryons immatures dans la fixation de lignées pures par la méthode de filiation monograine (SSD), afin d'accélérer la sélection.
La culture in vitro peut être utilisée pour sélectionner des plantes résistantes au déficit hydrique en soumettant les embryons ou les plantules à des contraintes hydriques contrôlées.
Production de plantes haploïdes et lignées pures
L’haplodiploïdisation est une méthode utilisée pour fixer plus rapidement le matériel génétique en cours de sélection. Elle repose sur l’obtention de plantes haploïdes (n) à partir des organes mâles ou femelles puis sur le doublement du stock chromosomique. Ainsi le sélectionneur va disposer de plantes diploïdes (2n) homozygotes où l’ensemble du génome est fixé. C’est donc une technique rapide de production de lignées pures en une seule étape au lieu de 7 à 8 générations. Avec cette méthode, la durée d’un cycle de sélection est raccourcie de 3 à 4 ans.
La culture d'embryons immatures peut être combinée à des techniques d'haplodiploïdisation pour produire rapidement des lignées pures homozygotes, ce qui accélère considérablement le processus de sélection.
Transformation génétique
RésuméLe tournesol demeure, à ce jour, une des plantes encore récalcitrantes à la transformation génétique. Au cours de ce travail, diverses techniques ont été optimisées et une méthode originale de sélection d'embryons immatures sur kanamycine a été élaborée, permettant l'obtention de tournesols transgéniques même à partir de lignées récalcitrantes. Ces avancées techniques ont permis d'aborder l'étude de l'expression génique chez cette plante.
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La culture d'embryons immatures est une étape cruciale dans la transformation génétique du tournesol, permettant de sélectionner et de régénérer des plantes transgéniques à partir de cellules transformées.
Amélioration de la tolérance au stress hydrique
Pour la première approche, un hybride interspécifique entre H. Annuus et H. Anomalus a été fabriqué, dans le but d'obtenir du matériel possédant une base génétique élargie. Ceci pour faciliter la sélection ''in vitro'' des génotypes plus résistants au déficit hydrique. Nous avons constaté qu'au fur et à mesure que la concentration du mannitol augmente, le développement des embryons et des plantules diminue. Le potentiel hydrique foliaire aussi tend à diminuer avec l'augmentation de la concentration en mannitol. Les plantes adultes provenant de descendances sélectionnées par mannitol au stade ''jeunes plantules'', sont plus proches du phénotype H. Anomalus que celles qui proviennent des descendances témoins ou sélectionnées sur mannitol au stade ''embryons''. Le test sécheresse sur descendances F5 montre que le matériel qui a subi une sélection sur mannitol ''in vitro'', présente des réponses différentes par rapport au témoin vis-à-vis du stress. La méthode de sélection précoce sur ''mannitol in vitro'' pourrait permettre, de façon relativement simple de sélectionner des plantes présentant certaines caractéristiques foliaires plus adaptées à supporter les conditions de sécheresse au champ.
La culture in vitro d'embryons immatures est utilisée pour sélectionner des plantes tolérantes au stress hydrique en utilisant du mannitol pour simuler des conditions de sécheresse. Les plantes sélectionnées présentent des caractéristiques foliaires plus adaptées aux conditions de sécheresse au champ.
Fixation de lignées pures
La deuxième approche nous a permis d'obtenir des semences F5 en 375 jours à partir du croisement diallèle initial de 7 parents. Les effets de la culture ''in vitro'' se traduisent par une série de modifications morphovégétatives et physiologiques sur les plantes qui ont été limitées par réduction de la durée du séjour ''in vitro''. L'évaluation de la variabilité génétique des lignées pures (F6) issues de la culture d'embryons immatures a été réalisée dans un délai de 890 jours. Les résultats montrent un élargissement de la variabilité au niveau des lignées issues du croisement diallèle par rapport aux parents. En outre le dispositif a permis de tester la présence d'épistasie (homozygote x homozygote) chez les lignées F6. L'analyse factorielle discriminante de l'aptitude à la combinaison, qui reflète une divergence génétique, a permis de détecter le rapport de parenté entre les géniteurs. D'autre part, entre les descendances F3 et F5, des corrélations phénotypiques significatives ont été mises en évidence pour 6 des caractères étudiés. Par contre une assez forte variation de ces deux types de corrélations a été constatée sur 3 familles entre les lignées F6 et la valeur hybride en F4.
La culture d'embryons immatures est utilisée pour fixer des lignées pures en accélérant le processus de sélection par filiation monograine (SSD). Cette méthode permet d'évaluer la variabilité génétique et de détecter les relations de parenté entre les géniteurs.
Production de plantes haploïdes : Androgenèse et Gynogenèse
L’androgenèse a été la première voie d’obtention d’haploïdes in vitro. Les plantes haploïdes ont été obtenues par culture d’anthères (sacs contenant le pollen). Plus récemment, la culture de microspores (grains de pollen immatures) a été mise au point.
Haploïdie induite par gynogenèse Elle consiste à mettre en culture in vitro des ovules ou des ovaires prélevés sur la plante avant fécondation. Des plantes haploïdes ont pu être obtenues chez l’orge, le tabac, le blé, le riz, le maïs, la betterave… Sur la betterave, la gynogenèse est la technique la plus opérationnelle de production d’haploïdes, même si on obtient moins de 8% d’haploïdes. Elle permet notamment de travailler sur des betteraves mâles fertiles, aussi bien que sur des betteraves mâles stériles (contrairement à la culture d’anthères). Les fleurs sont disséquées sous la loupe binoculaire en conditions aseptiques. Les ovules sont déposés sur une boîte de pétri contenant un milieu inducteur et sont placés en chambre de culture.
L'androgenèse et la gynogenèse sont des techniques de culture in vitro qui permettent d'obtenir des plantes haploïdes à partir de cellules reproductrices mâles (anthères ou microspores) ou femelles (ovules ou ovaires). Ces plantes haploïdes peuvent ensuite être doublées pour obtenir des lignées pures homozygotes.
Culture d’anthères
L’androgenèse est la voie d’haplodiploïdisation privilégiée chez le blé, car il est relativement facile de mettre en culture un très grand nombre d’anthères. Ainsi, cette technique a été mise en place dans les programmes de sélection du blé tendre. Les épis sont récoltés au stade montaison d’où les anthères sont extraites en conditions stériles. Elles sont mises en culture en boîte de pétri sur des milieux spécifiques, induisant le développement embryonnaire des microspores. Des examens cytologiques préalables sont nécessaires pour connaître le moment de prélèvement le plus favorable à ce développement. Les boîtes de pétri sont ensuite placées dans des chambres de culture où l’éclairement, la température et l’humidité sont contrôlés pour favoriser l’androgenèse. Quelques semaines après la mise en culture des anthères, les embryons haploïdes apparaissent. Ils sont prélevés sous loupe binoculaire et repiqués sur des milieux nutritifs permettant une différenciation des tissus et l’induction du développement de la plante. Les plantules bien développées sont à nouveau repiquées en tube. Cette voie androgénétique est utilisée chez le blé, le riz, la pomme de terre, le tabac, le maïs, l’asperge et le piment et est très efficace sur colza, l’orge et l’aubergine.
Culture de microspores
Elle est utilisée en routine sur les crucifères comme le colza. Elle reste actuellement difficile sur les céréales (avoine, blé, riz…) et les légumineuses. Chez le colza, les boutons floraux sont sélectionnés sur les inflorescences. Les grains de pollen immatures sont isolés mécaniquement par broyage des boutons, et filtration de la suspension. On induit directement la formation d’embryons par la culture des microspores en milieu liquide agité. A partir d’embryons de trois semaines, il est ensuite possible de régénérer des plantes. La variété de colza d’hiver Goéland, inscrite en 1990, est issue de cette technique.
Haploïdie induite par croisement interspécifique ou inter-générique
Haploïdie induite par croisement interspécifique Le croisement interspécifique entre une espèce cultivée et une espèce sauvage permet parfois de produire des plantes haploïdes. En effet, après fécondation au cours des premières divisions cellulaires, les chromosomes de l’espèce sauvage sont éliminés. On obtient ainsi un embryon haploïde ne comportant que les chromosomes de l’espèce cultivée. Cette méthode s’applique à l’orge, à la pomme de terre, ainsi qu’à quelques génotypes de blé. Le croisement interspécifique de l’orge cultivée et de l’orge sauvage bulbeuse permet l’obtention d’embryons haploïdes d’orge cultivée. La culture in vitro est alors nécessaire pour permettre à ce type d’embryon de poursuivre son développement et de donner une plante. Une application particulière est utilisée pour la sélection de la pomme de terre. La pomme de terre cultivée est tétraploïde (4n = 48). La réduction du stock chromosomique est obtenue par pollinisation de la pomme de terre cultivée par une espèce sauvage Solanum phureja. Ce système permet d’obtenir des plantes diploïdes. Ces plantes peuvent être alors facilement croisées par des espèces sauvages, fréquemment diploïdes, ce qui permet de restaurer la tétraploïdie. Cette méthode est utilisée pour apporter de nouveaux caractères chez la pomme de terre cultivée.
Haploïdie induite par croisement inter-générique Plus récemment, les croisements entre genres ont été étudiés. La pollinisation du blé dur par du pollen de maïs offre la possibilité de produire des plantes haploïdes chez le blé dur, espèce récalcitrante aux techniques de culture d’anthères.
Les croisements interspécifiques ou inter-génériques peuvent induire l'haploïdie en éliminant les chromosomes d'une des espèces parentales après la fécondation. La culture in vitro est alors nécessaire pour permettre le développement de l'embryon haploïde.
Haploïdie induite par l’utilisation de pollen dénaturé
Haploïdie induite par l’utilisation de pollen dénaturé L’induction d’haploïdes est également possible par pollinisation avec du pollen dénaturé par irradiation. Cette technique s’est révélée utile pour tout un ensemble d’espèces légumières et est utilisée couramment chez le melon. L’étape de culture in vitro des embryons haploïdes est là aussi obligatoire.
La pollinisation avec du pollen dénaturé par irradiation peut induire l'haploïdie. La culture in vitro des embryons haploïdes est obligatoire pour permettre leur développement.
Applications de l'haploïdie à la production d'hybrides chez l'asperge
Application particulière à la production d’hybrides chez l’asperge L’androgénèse a été particulièrement exploitée chez l’asperge, car elle est le seul moyen efficace pour produire des variétés hybrides mâles. L’asperge est une espèce dioïque : elle possède des pieds mâles et des pieds femelles. Les plantes mâles sont recherchées en sélection, car elles sont précoces et plus productives. Les pieds mâles sont Mm pour les chromosomes sexuels et les femelles sont mm. La voie de l’androgenèse permet d’obtenir soit des individus MM appelés super-mâles, soit des individus mm donc femelles. Les croisements de ces super-mâles avec des femelles donnent des individus mâles, ce qui permet en les sélectionnant de pouvoir créer des variétés hybrides mâles. Ainsi, cela permet d’exploiter l’hétérosis, important chez cette espèce.
Chez l'asperge, l'androgenèse est utilisée pour produire des variétés hybrides mâles en croisant des super-mâles (MM) avec des femelles (mm).
Défis et perspectives
Bien que la culture d'embryons immatures offre de nombreux avantages pour l'amélioration du tournesol, elle présente également des défis. L'un des principaux défis est la difficulté de régénérer des plantes à partir d'embryons immatures de certains génotypes. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour optimiser les protocoles de culture et améliorer les taux de régénération.
Malgré ces défis, la culture d'embryons immatures reste un outil précieux pour l'amélioration du tournesol. Les avancées récentes dans ce domaine, telles que le développement de méthodes de sélection assistée par culture in vitro et l'utilisation de la transgénèse, ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de variétés de tournesol plus performantes et adaptées aux défis environnementaux.
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