Introduction
La biopsie d'embryon bovin est une technique de pointe qui a révolutionné l'élevage bovin en permettant la sélection génétique précoce et le sexage des embryons. Cette pratique, combinée à d'autres biotechnologies de la reproduction, offre aux éleveurs des outils puissants pour améliorer la qualité génétique de leurs troupeaux, gérer les problèmes sanitaires et optimiser la production.
Transplantation Embryonnaire : Une base solide
Depuis les années 1980, la transplantation embryonnaire (TE) est une méthode couramment utilisée par les éleveurs pour valoriser leurs femelles en vendant des embryons ou en produisant des mâles destinés aux centres d'insémination artificielle (CIA). L'embryon est également un moyen d'introduire un meilleur potentiel génétique ou une autre race dans un troupeau. En cas de problèmes sanitaires graves, l'embryon, sous certaines contraintes légales, permet de stocker temporairement du matériel génétique. Après la collecte, les embryons peuvent être sexés avant d'être transférés à des receveuses ou congelés.
L'efficacité de la transplantation sur le terrain reste inégalée par la fécondation in vitro (FIV) ou le clonage. L'amélioration de son efficacité et de sa rentabilité passe par l'utilisation de semence sexée et, potentiellement, par la recherche de marqueurs génétiques directement sur une biopsie.
Sexage des Embryons : Augmenter le nombre de femelles
Le sexage des embryons, associé au transfert, permet d'augmenter le nombre de femelles nées dans les élevages.
Technique de sexage
Techniquement, après la collecte, quelques cellules (5 à 10) sont prélevées sur chaque embryon par microchirurgie à l'aide d'un micro-couteau. Ces cellules contiennent le patrimoine génétique du futur veau sous forme de chromosomes sexuels X et Y. Les femelles portent deux chromosomes X, tandis que les mâles portent un chromosome X et un chromosome Y.
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Étapes du sexage
- PCR (Réaction de Polymérisation en Chaîne) : Cette technique permet de copier à l'infini un fragment spécifique d'ADN des chromosomes X et Y.
- Électrophorèse : Elle permet de séparer les fragments de X des fragments de Y, qui se regroupent en deux bandes distinctes, visualisables sous éclairage ultraviolet.
- Biopsie : Une biopsie qui donne l'image d'une seule bande X identifie un embryon "femelle", tandis que la présence d'une bande X et d'une bande Y identifie un "mâle".
La majorité des femelles sont transférées le jour même de la collecte sur des génisses receveuses.
Limites du sexage
Dans certains cas, l'amplification de l'ADN ne se fait pas correctement. Si aucune bande n'est révélée (ni X, ni Y), le sexe de l'embryon est impossible à déterminer. Cela arrive dans 3 à 4 % des cas. Si une bande X apparaît seule, on identifie une femelle, mais dans quelques cas, un veau mâle peut naître, car le chromosome Y est parfois plus difficile à révéler.
Expérience en sexage
Des études ont montré une fiabilité de 100% dans la recherche des mâles et supérieure à 97% pour les femelles, avec un taux de gestation supérieur à 60%. La pratique de cette technique nécessite du matériel et des produits spécifiques et coûteux, ainsi que plus de temps (8 à 10 heures de la collecte à la pose des femelles), ce qui justifie le surcoût.
Une nouvelle technique de congélation spécifique aux embryons sexés permet d'obtenir 60% de gestation après la mise en place d'embryons femelles congelés. Il est donc possible de congeler le surplus d'embryons femelles ou de les stocker en cas de manque de receveuses.
Biopsie et Bissection : Amélioration des techniques
Objectifs
- Connaître les bases de la méthodologie pour réaliser des biopsies ou des bissections par coupe sur les embryons bovins.
- Réaliser au quotidien des biopsies/bissections sur des embryons produits in vitro ou collectés in vivo, sans altérer leur capacité de développement.
Programme
- Principes de base de la biopsie/bissection d’embryons in vitro.
- Rappel théorique et description du protocole.
- Fabrication de pipettes de maintien et de couteaux.
- Préparation et réglage des outils de micromanipulation.
- Réalisation de biopsies ou de bissections par coupe sur embryons produits in vitro ou collectés in vivo et congelés.
- Travaux pratiques en laboratoire.
- Échanges sur les bonnes pratiques et débriefing.
Un accompagnement renforcé du stagiaire peut être mis en place post-formation.
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Public cible
Techniciens de laboratoire connaissant les principes de la production d'embryons bovins.
Avancées scientifiques et techniques
Le transfert embryonnaire et le sexage des embryons sont les biotechnologies qui connaissent les principales avancées scientifiques et techniques, permettant leur développement sur le terrain. Le sexage est largement utilisé en France grâce à l'outil mis au point par la filière INRA-Rhône Merieux-UNCEIA. La méthode de sexage par PCR, qui consiste à mettre en évidence une séquence spécifique de l'ADN du chromosome Y dans quelques cellules (biopsie), s'est avérée efficace (95 %) et exacte (100 %). Le taux de gestation des embryons biopsiés (micro-couteau) et sexés est intéressant si l'on modifie le milieu de congélation (éthylène glycol) : 57,9 %, presque équivalent à celui des embryons sexés et transférés frais : 59,1%.
Le sexage des embryons permet aux éleveurs d'obtenir, avec une grande certitude, des veaux du sexe désiré à partir d'un accouplement donné, et d'améliorer la gestion de leurs receveuses.
Sélection Génomique et Biopsie
La sélection génomique, associée au développement des technologies de la reproduction, permet de réaliser le génotypage préimplantatoire et l'indexation des embryons pour les trois principales races bovines. La France est un leader en génomique pour la sélection des bovins laitiers prim'holstein, montbéliarde et normande.
Des stratégies d'évaluation génétique des embryons collectés 7 jours après insémination sont combinées à la biopsie de cellules embryonnaires, à la superovulation, au transfert d'embryon et à la ponction d'ovocytes (OPU-FIV). Les étapes conduisant à l'estimation du potentiel génétique de l'embryon et les principaux aspects pratiques assurant un génotypage réussi ont été mis au point. Ces outils facilitent la gestion des receveuses et le diagnostic précoce des anomalies génétiques. Le premier veau génotypé et indexé au stade embryonnaire est né en 2011, avec une parfaite concordance entre ses index estimés avant son implantation et ceux calculés après sa naissance.
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Prélèvement de cellules embryonnaires sans altérer la viabilité
Le défi est de prélever suffisamment d'ADN pour l'analyse tout en préservant la viabilité de l'embryon. Les embryons biopsiés sont cultivés in vitro pendant 24 à 48 heures ou transférés frais ou congelés chez des receveuses synchronisées. Les taux de gestation varient de 47,3 à 62,3 % après transfert direct d'embryons biopsiés congelés, selon le stade de développement embryonnaire ou la méthode de biopsie. La congélation des embryons produits in vitro et biopsiés reste un défi technique. L'ajout de sucrose au milieu de congélation améliore les taux de survie après décongélation.
Stratégies pour assurer une production d'ADN génomique suffisante
Un des défis majeurs de la sélection génomique au stade embryonnaire est la détection de SNP à partir d'un petit échantillon d'ADN prélevé chez un embryon préimplantatoire. Plusieurs études ont montré que le faible nombre de cellules par biopsie est suffisant pour le diagnostic pré-implantatoire d'un seul caractère en utilisant la technique d'amplification PCR suivie d'une électrophorèse.
L'amplification du pangénome (WGA) est possible grâce à de nouvelles techniques de biologie moléculaire. Cette méthode a été développée pour la préamplification de petites quantités d'ADN génomique afin d'utiliser une cellule unique. Des kits commerciaux d'amplification selon la méthode WGA sont disponibles avec de bonnes fiabilité et exactitude. L'ADN génomique préamplifié à partir de cellules embryonnaires issues de diverses espèces (porcine, caprine, bovine et humaine) est utilisé dans de nombreuses études.
Dans des conditions de terrain, l'ADN issu de biopsies d'embryon bovins est amplifié avec le mini-kit ultrarapide WGA-REPLI-g, selon un protocole mis au point par l'UNCEIA. Après amplification, le processus génère une quantité d'ADN génomique de 5 à 7 µg, c'est-à-dire 40 000 fois supérieure, au minimum, à la quantité initiale. Pour assurer le succès du génotypage, il est conseillé de garder les échantillons congelés durant le transport vers un laboratoire moléculaire centralisé.
Du génotypage à l'index génomique de l'embryon
- Évaluation de l'efficacité du génotypage : La faisabilité de l'indexation génomique des embryons a été vérifiée en comparant les taux de marqueurs détectés à partir de cellules embryonnaires (embryons collectés in vivo) et d'un prélèvement de sang chez le veau issu du transfert. Le génotypage a été réalisé à l'aide de la puce bovine Illumina SNP50®. Toutefois, des phénomènes de "perte d'allèles" sont observés, ce qui nécessite d'adapter la méthode de calcul utilisée pour l'indexation et de fixer un seuil en deçà duquel le génotypage n'est pas possible.
- Indexation génomique des embryons : En raison des phénomènes de perte d'allèles, la méthode d'indexation fait intervenir un modèle d'imputation dans lequel seuls les marqueurs "fiables" sont pris en compte pour l'estimation des index génomiques. Les index génomiques (production de lait, caractères morphologiques et fonctionnels) sont calculés chez les embryons, puis comparés à ceux des veaux correspondants prélevés après leur naissance.
Pour le moment, le génotypage des embryons ne peut être effectué avec fiabilité que pour les trois grandes races laitières prim’holstein, montbéliarde et normande, car l’interprétation du génotypage nécessite de disposer d’une population importante comme base de référence afin d’imputer certains marqueurs.
En Pratique
L'indexation génomique des embryons est désormais opérationnelle pour les trois grandes races laitières. Sa mise en œuvre nécessite une équipe de transfert embryonnaire formée à la micromanipulation des embryons et à la préparation de l'ADN avant génotypage. L'ADN est ensuite transmis à un laboratoire de génotypage et l'étape finale d'indexation est suivie par une société spécialisée. L'indexation des embryons suit la même chaîne informatique et le même calendrier que les autres animaux. Le surcoût pour un embryon est de l’ordre de 150 à 200 €.
Autres biotechnologies de la reproduction
La recherche d'animaux génétiquement supérieurs est un objectif constant de la production animale. Parmi les principales biotechniques utilisées pour favoriser l’augmentation de la productivité des troupeaux, on distingue : l’insémination artificielle (IA), la production in vitro (PIV) et le transfert d’embryons (TE).
Insémination artificielle (IA)
L'IA s'est répandue dans les troupeaux du monde entier, principalement après la maîtrise de la technique de congélation de la semence, qui permettait de stocker et de transporter la semence pendant une période prolongée et sur de longues distances.
Production in vitro (PIV) et transfert d’embryons bovins (TE)
La PIV et le TE permettent à la femelle de contribuer également au progrès génétique des troupeaux. La congélation des embryons, produits par TE et PIV, permet la commercialisation de matériel génétique animal de haute qualité. Après avoir maîtrisé la technique PIV et obtenu des grossesses, la manipulation génétique des embryons et de l’ADN est devenue viable.
Transfert nucléaire (TN)
En 1997, le premier clone produit par la technique du transfert nucléaire (TN) naissait d'une cellule animale adulte : Dolly la brebis. L'objectif commercial de la NT est la reproduction d'animaux transgéniques et d'animaux à haute valeur génétique, cependant, cette technique a encore une très faible efficacité.
Transgénèse
Actuellement, malgré des aspects juridiques, une biotechnologie très prometteuse est la transgénèse, qui consiste à contrôler l'expression de gènes d'intérêt.
Embryo Transfer (ET)
L'ET consiste en une stimulation hormonale d'une donneuse, une insémination au moment de l'oestrus et un prélèvement d'embryons au bout de 7 jours, par lavage de l'utérus. En moyenne, 4 à 6 embryons viables sont récupérés par donneur. L’ET permet ainsi d’augmenter de 2 à 3 fois le nombre de petits produits par une vache au cours de sa vie reproductive. Cependant, un problème fréquent en ET est la variabilité des résultats obtenus : la plupart des donneuses ne répondent pas à la superovulation ou répondent avec peu d'embryons (1 à 3).
Production In Vitro (PIV)
La PIV consiste à récupérer des gamètes femelles (ovocytes) de femelles d'âge et d'état physiologique variés et à réaliser 3 étapes en laboratoire : maturation, fécondation et culture in vitro. L’obtention massive d’ovocytes pour le PIV, à partir d’animaux vivants de haute valeur génétique, n’est devenue commercialement possible qu’après le développement de la technique d’aspiration transvaginale guidée par échographie (OPU).
L'OPU peut être appliqué aux veaux (âgés de plus de 6 mois), aux génisses, aux vaches gestantes (jusqu'à 3 mois de gestation) ou non, y compris jusqu'à 2-3 semaines après la naissance, car la technique n'interfère pas avec le cycle reproductif des le donateur. L'OPU peut être réalisée jusqu'à deux fois par semaine pendant plusieurs semaines ou mois et permet d'obtenir 2 fois plus d'embryons que la TE dans le même intervalle de temps. Cependant, il existe un consensus selon lequel les aspirations à intervalles bimensuels ou mensuels entraînent moins d'usure des animaux.
Parmi les étapes réalisées en laboratoire, la maturation in vitro (IVM) consiste en la sélection et la culture d'ovocytes de grade I, II et III, dans un milieu spécifique et dans des conditions contrôlées de température, d'atmosphère gazeuse et d'humidité, pendant une durée de 20 à 24 heures. La fécondation in vitro (FIV) repose sur la culture simultanée d'ovocytes et de spermatozoïdes pendant 6 à 18 heures. Ainsi, la FIV est influencée à la fois par la qualité de l’ovocyte et du sperme.
Le PIV favorise 30 à 50 % du développement embryonnaire et permet la production d'embryons pour le sexage, la bissection, le transfert, la transgenèse, le clonage et la cryoconservation. Les taux de grossesse dus au PIV sont très variables et diminuent encore davantage lorsque des embryons congelés sont utilisés. Le prélèvement d'ovocytes par OPU associé au PIV permet la production d'une grossesse par donneuse et par semaine. L’objectif commercial du PIV est d’obtenir une progéniture à partir de femelles qui ne peuvent pas les produire par les techniques conventionnelles. Actuellement, le PIV est un complément au programme ET et est appliqué aux femmes qui ne répondent pas aux traitements de surstimulation, qui ne produisent pas d'embryons transférables ou qui ont acquis des anomalies dans l'appareil reproducteur, telles que des adhérences ovariennes ou des obstructions des trompes. De plus, le PIV peut être utilisé chez les animaux en fin de vie (en raison de l’âge, d’une maladie ou d’un accident).
Sélection du sexe de la progéniture
La sélection du sexe de la progéniture en fonction de la demande commerciale de la propriété (remplacement ou agrandissement du troupeau, vente de mâles pour la viande, etc.) a toujours été d'un grand intérêt pour le producteur rural. Le sexage peut être réalisé précocement, sur le sperme ou l'embryon, ou plus tard sur le fœtus, par échographie. Au Brésil, la production de sperme sexé est encore en phase de recherche et le sexage des embryons nécessite une biopsie et une PCR (technique de biologie moléculaire), nécessitant donc un environnement aseptique et un équipement spécifique.
Facteurs influençant le PIV
Plusieurs facteurs affectent l’efficacité des programmes OPU-PIV. La superstimulation aux hormones (FSH) augmente le nombre et la qualité des ovocytes et le nombre d'embryons transférables par séance, et la race des animaux et la compétence du technicien réalisant l'OPU influencent les résultats obtenus. Des études démontrent l'influence de la capacité de la donneuse à fournir des ovocytes : variations du taux de blastocystes chez les donneuses évaluées. En plus de ce facteur, l’âge de l’animal peut interférer avec la production d’ovocytes et d’embryons. Le taureau, le départ de semence et l'interaction taureau-vache influencent la qualité des embryons et les taux de gestation.
Limites du PIV
Malgré des résultats prometteurs, le PIV présente encore des limites, telles que : faible développement en blastocyste, difficulté à congeler les embryons, moindre viabilité des ovocytes de femelles prépubères, coût de l'embryon (supérieur à TE), dépendance à l'état du donneur.
Sexage en laboratoire mobile
La méthode de sexage en laboratoire mobile, mise en service par Gènes Diffusion, permet de limiter la manipulation des embryons.
Technique de sexage par PCR en temps réel (qPCR)
La technique de sexage des embryons par PCR (amplification en chaîne par polymérase) est utilisée en France depuis 1990. Elle consiste à dupliquer in vitro une faible quantité d'ADN prélevée sur l'embryon pour déterminer son profil génétique. Le protocole repose sur la réalisation d'une biopsie, c'est-à-dire le prélèvement de cinq à dix cellules de l'embryon par micromanipulation à l'aide d'un microscope, afin d'extraire des fragments d'ADN. Ces fragments sont mis en étuve dans un mix réactionnel afin d'en obtenir plusieurs millions de copies identiques sous l'action d'enzymes (amplification).
Les techniciens en transplantation embryonnaire utilisent désormais un protocole de sexage des embryons par PCR en temps réel, appelé qPCR. Cette méthode permet de visualiser en temps réel la lecture des fragments d'ADN, réduisant le temps d'analyse à 1 h 30, soit 45 min de moins par analyse qu'une PCR classique.
En réduisant la durée de l'analyse, l'embryon passe moins de temps hors de l'utérus maternel, ce qui vise à améliorer le taux de réussite en gestation. Cette technique de sexage largement utilisée au Canada est réalisable à la ferme à partir d'un laboratoire mobile.
Optimisation du taux de gestation
Optimiser le taux de gestation est un argument économique à faire valoir pour promouvoir la transplantation embryonnaire. Le taux de gestation moyen après transplantation d'embryons frais sexés par PCR est de 60 % et de 52 % avec des embryons sexés et congelés. Il est de 65 % avec des embryons frais non sexés.
Le raccourcissement du temps d'analyse renforce l'efficacité des techniciens, ce qui rend plus facile l'organisation du chantier de sexage et le transfert d'embryons frais, en particulier chez les femelles ayant présenté une forte réponse à la superovulation. Si le nombre de receveuses s'avère limité par rapport au nombre d'embryons viables prélevés, la congélation est un recours. À l'inverse, lorsque la quantité d'embryons est inférieure au nombre de receveuses disponibles, l'embryon peut être coupé en deux lors d'une opération de chirurgie réalisée dans le laboratoire mobile avant d'être implanté sur deux receveuses.
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