Introduction
Comment et quand les cellules d’un organisme en développement savent ce qu’elles sont (identité) et où elles se trouvent (information de position) sont des questions fondamentales en biologie du développement. Chez les organismes pluricellulaires, chaque cellule a une structure particulière associée à une fonction spécifique et occupe une position précise. Les cellules doivent donc interpréter les signaux positionnels qui les orientent vers leur destin. Cet article explore les mécanismes complexes qui régissent le développement du rhombencéphale chez l'embryon de souris, en mettant en lumière le rôle crucial des morphogènes, des gènes Hox et des interactions cellulaires.
L'information de position et les morphogènes
L’idée que les cellules adoptent des destins différents en détectant la présence ou l’absence de produits chimiques, appelés facteurs déterminants du destin ou «déterminants» remonte au début du XXème siècle. L’expérience de Spemann et Mangold en 1924, avec la transplantation de la lèvre dorsale du blastopore d’un embryon d’amphibien sur la région ventrale d’un autre embryon, a permis de cimenter l’idée qu’une population de cellules peut contrôler le destin d’autres cellules. Les cellules du greffon n’ont que marginalement participées à ces nouvelles structures : il s’agit bien d’une instruction envoyée par un groupe de cellules à un autre groupe de cellules qui a changé sa destinée.
En 1969, Lewis Wolpert a postulé que les cellules pouvaient déterminer leur destin en interprétant les concentrations locales de ces profils gradués, et il a inventé la notion abstraite selon laquelle ces profils contiennent des «informations de position».
Les morphogènes sont des molécules distribuées de manière graduée qui fournissent des indices de position pour la spécification du destin cellulaire au cours du développement. En général, les morphogènes sont des protéines excrétées, produites à partir de sources localisées et qui diffusent dans l’espace extracellulaire vers les cellules voisines. Une fois que les gradients sont formés, les cellules réceptrices interprètent leur position respective dans le tissu en détectant la concentration de morphogènes. En réponse, les cellules activent différents ensembles de gènes cibles, initiant ainsi des processus de détermination et définissant finalement le destin des cellules.
Gradients de morphogènes et destins cellulaires
Un exemple classique est le modèle du drapeau français, où des groupes adjacents de cellules sont délimités par un seuil de concentration, définissant une limite. La détermination du destin dans ce modèle est due à l’interprétation par les cellules de la concentration du morphogène. L’information est donc contenue dans la valeur de la concentration à une position donnée, et dans la cascade moléculaire qui transforme cette valeur en réponse cellulaire.
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Les concentrations de morphogène de deux gradients orthogonaux agissent comme des coordonnées de position, définissant une carte de destin spatial bidimensionnelle. De plus, il arrive souvent que deux gradients de morphogènes s’opposent le long d’un même axe, permettant de raffiner la différenciation des destins le long de cet axe.
Exemples de morphogènes
En 1989, la première molécule de morphogène a finalement été découverte, la protéine Bicoid dans l’embryon de drosophile. Cette découverte a été immédiatement suivie par la démonstration qu’un ligand de la famille des TGFbeta, l’activine, détermine les destins différentiels des cellules en fonction des seuils de concentration.
Chez les embryons de drosophile, deux morphogènes, dorsal (Dl) et bicoid (Bcd), contrôlent la mise en place de deux axes corporels: respectivement dorso-ventral et antéro-postérieur. Ces morphogènes spécifiques sont inhabituels car ce sont des facteurs de transcription et ils agissent directement dans les noyaux avant la cellularisation de l’embryon de drosophile; par conséquent, les réponses de leurs gènes cibles ne reposent pas sur de vastes cascades de signalisation intracellulaire, mais sur une action directe de ces morphogènes.
Traduction des concentrations de morphogènes en expression génique
L’un des principaux problèmes étudiés en ce qui concerne les morphogènes est le mécanisme par lequel leurs diverses concentrations sont traduites en expressions géniques différentielles. Un modèle propose que les différences dans les domaines d’expression spatiale des gènes cibles sont directement liées à la concentration de morphogène. Dans ce modèle, la transcription du gène cible est initiée uniquement lorsque la concentration de morphogène est au-dessus d’un certain seuil, alors que la transcription n’est pas initiée dans les domaines où la concentration de morphogène est présente en dessous.
L’expression du gène cible influencée par l’apport de morphogène dépend aussi de l’état d’expression génique des cellules réceptrices. Les réponses à un morphogène donné différeront entre les cellules réceptrices avec différents programmes d’expression génique pré-existants. On dira de ces cellules qu’elles ont des compétences différentes à répondre au morphogène.
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Mécanismes de transport des morphogènes
Au cœur de la notion de morphogène, se trouve le concept de gradient. Il existe au moins deux mécanismes de transport actif:
- Le transport basé sur les vésicules, notamment la transcytose et les migrasomes, dans lequel les ligands morphogènes naviguent à travers les tissus via des cycles répétés d’endo- et d’exocytose médiée par les récepteurs.
- Le transport médié par les cytonèmes, dans lequel de vastes réseaux de filopodes mis en place par les microfilaments d’actine agissent comme des conduits directs pour la transmission du morphogène aux cellules cibles. Il est également apparu que les cellules réceptrices peuvent envoyer des cytonèmes à la rencontre des cytonèmes qui sécrètent le morphogène.
Pour la diffusion régulée et la diffusion libre, il est utile de faire la distinction entre la diffusion régulée par des facteurs immobiles, tels que les récepteurs et co-récepteurs, ainsi que les composants de la matrice extracellulaire et d’autres interactants mobiles avec les morphogènes qui ont un impact sur sa plage et sa vitesse de diffusion.
Le rôle des gènes Hox dans le développement du rhombencéphale
Les gènes homéotiques, aussi nommés gènes Hox (Homeobox), interviennent dans la mise en place de l’axe antéro-postérieur. La séquence de ces gènes est très fortement conservée, du fait de leur importance primordiale lors du développement embryonnaire.
Organisation et expression des gènes Hox
Un gène est une zone fonctionnelle de l'ADN génomique qui code pour une protéine. Un gène peut être décomposé en une zone codante, qui contient l'information pour la protéine et sa fonction, et une zone promotrice, qui régule où et quand un gène est transcrit en ARN, donc ce qui fait que cette protéine est exprimée dans certaines cellules de l'embryon et à un moment précis.
L'expression des ARN messagers des gènes Hox est décelable dès la phase de gastrulation, au moment où l'embryon acquiert une polarité antéro-postérieure uniquement dans la partie postérieure des feuillets ectodermique et mésodermique, y compris la ligne primitive. Ultérieurement, ils sont exprimés dans de nombreuses structures de l'embryon en développement : le mésoderme des somites, le neuroderme, mais aussi les reins primitifs, le tubercule génital, les membres…
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Les transcrits d'homéogènes ne sont présents que dans la partie de la tête qui présente une organisation segmentée et qui représente, en termes de phylogénie, la partie la plus ancienne de la tête des organismes vertébrés : il s'agit des arcs branchiaux et du cerveau postérieur ou rhombencéphale, dit « cerveau primitif ».
Colinéarité spatiale
La caractéristique fondamentale des complexes HOX/HOM est la relation entre l'ordre physique des gènes le long du chromosome et l'ordre physique de leur expression le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon. Cette propriété appelée « colinéarité spatiale » a été découverte d'abord chez la drosophile. L'ordre des gènes correspond à la position des segments dans lesquels ils s'expriment normalement. Elle a été ensuite retrouvée chez les vertébrés, mais avec une particularité : les domaines d'expression se chevauchent.
Chez les vertébrés, l'embryon a une organisation qui n'est que transitoirement et partiellement segmentée, les signes les plus évidents de cette segmentation se trouvant dans les dérivés du neuroderme (dont dérivent le rhombencéphale et la moelle épinière) et le mésoderme (en particulier les somites, dont dérivent les vertèbres, les côtes, les muscles…). Dans les somites, la frontière antérieure entre les régions où le transcrit n'existe pas et celle où il existe est précise, alors que la frontière postérieure d'expression de l'homéogène est floue : le signal y est seulement de plus en plus atténué selon un gradient de concentration antéro-postérieur. Le même principe s'applique pour l'expression de gènes Hox dans le système nerveux central. Pour un même complexe HOX d'une espèce donnée, dans chacun de ces deux tissus, on retrouve la règle de colinéarité spatiale entre la position de l'homéogène au sein du complexe sur le chromosome et la limite antérieure de son domaine d'expression.
Exemple du gène HOXA1
La protéine Hox-A1 s’exprime dans le tube neural (future moelle épinière), chez le jeune embryon. HOXA1 s'exprime depuis le cerveau postérieur jusqu'à la partie la plus postérieur du tube neural. Les souris ayant les deux copies de ce gène inactivées meurent à la naissance, et présentent de graves défauts, en particulier : un retard de fermeture du tube neural, l’absence de certains nerfs crâniens et de certains ganglions, une malformation de l’oreille interne et des os du crâne. Or ces structures sont formées par des cellules qui quittent la face dorsale du tube neural au cours du développement : les cellules de crête neurale. On peut donc conclure que le gène HOXA1 a pour rôle, au cours du développement embryonnaire des Vertébrés, de spécifier la position de certaines cellules de crête neurale le long de l’axe antéropostérieur.
Les protéines hHox-A1 (Homme) et mHox-A1 (souris) sont remarquablement conservées : 92 % d’homologie de séquence. Ces deux protéines ont un poids moléculaire d’environ 35 kiloDalton. Il s’agit de facteurs de transcription, c’est-à-dire de protéines capables de se fixer sur l’ADN, pour réguler l’expression d’autres gènes. La fixation à l’ADN est réalisée grâce à un domaine particulier de la protéine : il s’agit de la « boîte homéotique ». Ce domaine est conservé à 100 % entre ces deux protéines. Les gènes HOXA1 de Vertébrés sont considérés comme étant les homologues du gène homéotique labial de la drosophile (Drosophila melanogaster). La comparaison de la protéine Labial avec Hox-A1 (de souris ou d’Homme) montre une homologie de séquence de 23 %, ce qui confirme que les gènes à l’origine de ces protéines (chez l’Homme, la souris et la drosophile) dérivent d’un même gène ancestral. En particulier, on retrouve chez ces trois gènes le même domaine de fixation à l’ADN. Il est semblable (séquence protéique) à 85 % entre la drosophile et l’Homme ou la souris.
Interactions cellulaires et neurulation
L'étude du développement embryonnaire et fœtal a connu une véritable révolution depuis quelques années grâce au développement de multiples techniques qui permettent de poser des questions fondamentales et d'essayer de soulever le voile des mécanismes qui sous-tendent ces processus.
Neurulation primaire
La neurulation primaire rend compte de la transformation de la plaque neurale issue de l'induction neurale en un tube neural. Plusieurs modes de transformation ont été décrits montrant la diversité des phénomènes qui peuvent s'appliquer à ces structures. Il est impossible de tenter d'être exhaustif ici ; néanmoins, il est important de prendre conscience que le modèle proposé est simpliste et la compréhension des dysfonctions de ce temps morphogénétique nécessite une approche pluridisciplinaire.
Ce temps morphogénétique rend compte de la déformation de la plaque neurale qui est initialement sous la forme d'un disque et qui se déforme pour prendre un aspect ovoïde (le grand axe est antéropostérieur, c'est-à-dire céphalocaudal ; le petit axe médiolatéral). Ce façonnage est aussi connu sous le terme générique de convergence - extension (convergence vers la ligne médiane et extension antéropostérieure). À l'issue de cette phase, le neurectoderme apparaît épaissi et prend le nom de plaque neurale. Le moteur de ce mouvement morphogénétique réside dans les changements de forme des cellules du neurectoderme, dans les mouvements d'intercalation cellulaire ainsi que dans la directionnalité des mitoses. Tout ceci est dicté par la voie Wnt comme pour tous les cas de convergence - extension au cours du développement. Une perturbation génétique de cette voie conduit à un défaut de fermeture du tube neural chez la souris.
Après le façonnage, le neurectoderme forme un épithélium prismatique et prend le nom de plaque neurale alors que l'ectoderme de surface est pavimenteux. La notochorde est située ventralement par rapport à la ligne médiane du neurectoderme. L'endoderme est le tissu le plus ventral de l'embryon à ce stade.
Le premier signe de cette phase morphogénétique est l'apparition d'un sillon médian au niveau de la plaque neurale. Puis, cette plaque se replie lors de la formation de charnières, la première qui se forme est la charnière médiane située dorsalement par rapport à la notochorde. La plaque repliée prend alors le nom de gouttière neurale. Puis, deux autres charnières se mettent en place dans les régions dorsolatérales. Ceci conduit les régions les plus latérales de la plaque neurale à se rapprocher de la ligne médiane dorsale. Ces régions latérales portent alors le nom de bourrelets neuraux. La plicature conduit au rapprochement des bords latéraux de l'ensemble plaque neurale - ectoderme de surface. À ce stade de développement, ces deux tissus sont fortement adhérents entre eux. Avec le rapprochement sur la ligne médiane dorsale, les deux régions latérales entrent en contact et les tissus homologues fusionnent : le neurectoderme (respectivement l'ectoderme de surface) avec son contingent controlatéral. Ainsi se forme le tube neural recouvert par l'ectoderme de surface. À ce stade, il n'existe pas d'espace entre ces deux tissus, un tel espace se forme plus tard.
Un tel processus morphogénétique n'est pas uniforme tout au long de l'axe antéropostérieur. Par exemple, l'aspect de la formation du tube neural céphalique est très différent. De plus, chez la souris, il existe des variantes morphologiques selon les grandes régions de la moelle spinale.
Il est important de constater que les deux lignes médianes du tube neural (en position ventrale et dorsale) n'ont pas du tout la même signification morphogénétique. Ceci suggère que la régulation de leur mise en place est différente et invite à une très grande prudence dans l'utilisation du terme « pathologies de la ligne médiane » pour rendre compte de toutes les malformations siégeant à ce niveau.
Les anomalies de la neurulation primaire entraînent un défaut de fermeture du tube neural qui reste alors exposé à la surface. Si ce défaut touche l'extrémité céphalique, il porte le nom d'anencéphalie ; s'il intéresse la moelle spinale, il se nomme myéloméningocèle ; enfin le craniorachischisis, très rare, touche l'ensemble de l'axe nerveux.
Cellules souches et développement embryonnaire
Les cellules souches pluripotentes (CSP) se divisent en deux types principaux : les cellules souches pluripotentes embryonnaires (CSPEs) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPIs).
Cellules souches pluripotentes embryonnaires (CSPEs)
Les CSPEs ont été isolées pour la première fois dans les années 1980 à partir d'embryons murins. Caractérisées par leur auto-renouvellement et leur potentiel de différenciation in vitro, les CSPEs de souris ont également la propriété unique de contribuer en plus du chimérisme somatique à la colonisation de la lignée germinale d'un embryon lorsqu'elles sont injectées dans un blastocyste préimplantatoire. Les CSPEs de primates non humains et humains ont été obtenues pour la première fois dans les années 1990 à partir de culture d'embryons préimplantatoires. Selon les espèces, les conditions de culture restent le point critique dans l'établissement et la plasticité de ces cellules.
Dans les années 2000, des cellules souches épiblastiques (EpiSCs) ont été isolées à partir d'un embryon de souris post-implantation. Contrairement aux CSPEs, les EpiSCs n'ont pas la propriété de contribuer au chimérisme in vivo bien qu'elles conservent les propriétés de différenciation in vitro dans les trois lignées embryonnaires (l'ectoderme, l'endoderme et le mésoderme). La propriété de colonisation de l'embryon et, en particulier, de colonisation germinale est actuellement considérée comme l'un des critères les plus exigeants, permettant de distinguer les CSPEs dans un état dit « naïf » versus un état « amorcé », dont l'archétype est représenté par les EpiSCs. De nombreuses publications ont caractérisé ces deux types de cellules souches qui diffèrent à la fois par leurs conditions de culture et leur potentiel développemental ainsi que par leurs caractéristiques moléculaires et épigénétiques.
Plus récemment, un état formatif a été introduit comme « une troisième phase, appelée pluripotence formative, proposée pour exister dans le cadre d'un continuum de développement entre les phases naïve et amorcée », état qui a pu être « capturé in vitro à la fois dans le modèle murin et humain. L'existence de ces mêmes stades - naïf, amorcé et formatif - chez d'autres espèces que les rongeurs est encore largement débattue, notamment dans les modèles primates non humains et humains, pour lesquels de nombreux travaux ont tenté de définir des conditions de culture pour obtenir et maintenir des cellules naïves. En particulier, l'utilisation de différents cocktails de petites molécules inhibant les voies de signalisation a été décrite, permettant d'obtenir des cellules naïves.
Chez les espèces d'intérêt agronomique, des cellules de type « souches pluripotentes embryonnaires - CSPEs » avec des propriétés d'auto-renouvellement et de différenciation ont été isolées, amplifiées et établies en lignées chez les porcins, les bovins, les ovins et caprins, les équins et les lapins. La plupart de ces cellules sont caractérisées par leur potentiel de prolifération et de différenciation in vitro et par la présence de certains marqueurs, comme les antigènes de surface, dont SSEA1, SSEA3 et SSEA4, des antigènes initialement identifiés chez la souris mais dont la réactivité croisée avec d'autres espèces s'est avérée importante pour l'identification de ces cellules. Mais leur potentiel développemental n'a pas été évalué.
Plus récemment, en utilisant des stratégies similaires à celles développées pour les cellules humaines (à base de cocktails de molécules inhibitrices), des études ont été menées pour obtenir des CSPEs plus « naïves » chez les espèces bovine et porcine même si des expériences de chimères n'étaient pas mentionnées. En parallèle, des analyses moléculaires réalisées au niveau de cellules isolées d'embryons préimplantatoires ont permis de mieux définir les marqueurs associés à ces stades précoces chez différentes espèces (bovins, porcs, lapins) et de les comparer avec la souris, le primate non humain et l'humain. Les dernières conditions mises au point pour les espèces bovine, porcine et ovine, calquées sur l'état formatif humain, semblent permettre l'obtention de lignées de cellules capables de coloniser efficacement les embryons, comme démontré dans le modèle porcin.
Cellules souches pluripotentes induites (CSPIs)
La mise au point de la reprogrammation somatique en 2006 a constitué une véritable révolution dans le domaine des CSP. En criblant un ensemble de 24 gènes tous fortement exprimés dans les CSP, l'équipe de S. Yamanaka a ainsi identifié une combinaison minimale de quatre gènes, les gènes OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC qui était capable de « reprogrammer » un fibroblaste c'est-à-dire de donner à cette cellule des propriétés similaires à une CSP. Cette combinaison OSKM est définie comme la combinatoire canonique de la reprogrammation. Ce concept de reprogrammation somatique consiste donc à exprimer une combinatoire de gènes - dont des facteurs de transcription impliqués dans le contrôle de la pluripotence - dans une cellule somatique, conduisant ainsi à sa reprogrammation en cellule souche pluripotente induite (CSPI). Par la suite, d'autres combinaisons ont été identifiées comme OSNL avec OCT4, SOX2, NANOG et LIN28) ainsi que le rôle d'autres gènes comme NR5A2, ESRRB, GLIS1, ZIC3, TBX3, H1F00, NKX3.2, et MIR302 (liste non exhaustive). Ces facteurs participent directement au processus de reprogrammation ou augmentent son efficacité.
Les CSPIs partagent la plupart des propriétés des CSPEs mais sans le questionnement éthique de l'utilisation et de la destruction des embryons lors de leur mise en culture. De plus, par cette approche de reprogrammation, des CSPIs peuvent être obtenues à partir de n'importe quel individu ou animal, sain ou malade, porteur de mutation génétique ou non, et donc de tout génotype ouvrant entre autres aussi la voie à l'étude de nombreuses pathologies, voir à une médecine personnalisée pour l'Homme. Initialement démontré dans le modèle murin, le concept a été rapidement étendu aux primates non humains, à l'homme et à de nombreuses autres espèces agronomiques comme les lapins, les moutons et les bovins, les porcs et les chevaux.
Développement du cervelet
Le cervelet dérive du tube neural et plus précisément du premier rhombomère (c.-à-d. la région la plus rostrale du métencéphale). Il est aujourd'hui clairement établi, tant chez les oiseaux que chez les rongeurs, que le cervelet est initialement présent sous la forme de deux ébauches séparées par la ligne médiodorsale. Il est à noter que la polarité antéropostérieure initiale de ces ébauches correspond à la future polarité médiolatérale du cervelet.
Le tube neural de la région rhombomérique se déforme à la suite du développement de l'ébauche du 4e ventricule qui prend la forme d'un losange. Cette déformation conduit à une bascule des ébauches cérébelleuses, leurs régions initialement rostrales devenant plus médianes. L'évolution de ce mouvement morphogénétique conduit à la fusion des régions médianes. À l'issue de ce temps morphogénétique, le rhombencéphale apparaît losangique en vue dorsale. Ce losange représente le futur 4e ventricule, son toit est constitué d'un tissu épithélial très fin.
Initialement, deux ébauches cérébelleuses sont présentes dans le tube neural. La région rostrale de ces ébauches donne naissance à la future région médiane du cervelet (M) alors que la région caudale participe à la formation des régions latérales (L). Avec la déformation de la région rhombencéphalique secondaire à la croissance de l'ébauche du 4e ventricule, l'axe rostrocaudal initial change et prend une direction médiolatérale. La croissance du ventricule conduit ensuite à la fusion des ébauches médianes (le tissu médian est chassé vers les régions rostrale et caudale).
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