L'étude des premières divisions cellulaires dans l'embryon de Drosophila melanogaster, communément appelée mouche du vinaigre, est un domaine crucial de la biologie du développement. Comprendre comment, à partir d'un simple œuf, un organisme complexe se développe, a fasciné les scientifiques pendant des siècles. La drosophile, grâce à sa petite taille, son cycle de vie rapide et sa facilité de manipulation génétique, est devenue un modèle de choix pour décrypter les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent le développement embryonnaire.
L'embryogenèse de la drosophile est un processus dynamique et complexe, caractérisé par des divisions cellulaires rapides et coordonnées, des mouvements cellulaires précis et une différenciation cellulaire progressive. Les premières divisions, en particulier, sont essentielles car elles établissent les axes corporels et déterminent le destin des différentes lignées cellulaires.
L'Importance de la Microscopie et de l'Analyse Informatique
Un enjeu majeur en biologie du développement est de pouvoir suivre la dynamique complexe des cellules qui composent un embryon. Pour cela, il faut disposer de systèmes optiques permettant de détecter et filmer les milliers de cellules qui se déplacent et se divisent à un rythme effréné. La microcinématographie à l'accéléré permet de suivre les phases successives de l'embryogenèse de la drosophile.
Il faut également des outils informatiques assez puissants pour enregistrer, restituer et analyser des images couvrant la totalité de l'embryon. C'est le tour de force qu'ont réalisé deux équipes, aux Etats-Unis et en Allemagne, dont les travaux ont été publiés en ligne dans la revue Nature Methods. "Pour atteindre cet objectif, une haute résolution spatiale et temporelle est essentielle pour suivre et distinguer des cellules au sein d'amas denses. Notre nouveau microscope permet pour la première fois d'étudier l'ensemble des mouvements et les divisions cellulaires lors du développement embryonnaire précoce", précise Phillip Keller, chercheur au Howard Hughes Medical Institute, à Ashburn (Virginie, Etats-Unis), investigateur principal de la première étude. Des résultats similaires ont été obtenus par l'équipe de Lars Hufnagel, du Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL), à Heidelberg (Allemagne).
Divisions Cellulaires Asymétriques : Un Mécanisme Clé du Développement
A l’issue de la mitose, les 2 cellules-fille ont certes reçu le même patrimoine génétique mais le contenu cytoplasmique reparti entre elles n’est pas forcément le même. Les cellules filles de telles divisions peuvent différer non seulement par leur héritage des déterminants cytoplasmiques, mais aussi par leur taille relative. De telles divisions asymétriques sont répandues au cours du développement. Pour que les divisions asymétriques se fassent selon le bon axe ou la bonne orientation (ce qui est particulièrement crucial pour les cellules végétales qui ne peuvent pas migrer à cause de la paroi), la position et l’orientation des fuseaux mitotiques est très étroitement contrôlée.
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Divisions Asymétriques lors de l’Embryogenèse Précoce de C. elegans
L’embryogenèse précoce chez le nématode C. elegans présente plusieurs divisions asymétriques qui produisent des cellules filles de différentes tailles et de différentes destinées. La symétrie du zygote est brisée par le centrosome apporté par le spermatozoïde. En parallèle de la réorganisation du réseau de microtubules autour du centrosome paternel, le réseau cortical d’actine-myosine contractile se déplace vers le futur embryon antérieur, accompagné de l’établissement de domaines corticaux mutuellement exclusifs des protéines PAR, avec aPKC-3/PAR-3/PAR-6 du côté antérieur et PAR-1/PAR-2/LGL-1 du côté postérieur. L’inhibition réciproque des protéines PAR antérieures et postérieurs est un élément essentiel de la polarisation.
Division Asymétrique Orientée lors du Développement Précoce de C. elegans
La première division zygotique chez C. elegans se déroule de manière asymétrique pour générer des cellules AB et P1 de taille et de contenu cytoplasmique différents. Les protéines Par dans le zygote sont localisées le long d’un axe cortical antérieur-postérieur : les complexes Par-3/Par-6/aPKC (rouge) localisés antérieurement et Par-1/Par-2 (bleu) localisés postérieurement se répriment mutuellement. L’orientation du fuseau le long de cet axe de polarité est régulée par le complexe GPR-1/2 et LIN-5 (qui est enrichi au niveau du cortex postérieur), assurant une asymétrie correcte dans la distribution des protéines de polarité dans les cellules filles. Ce complexe induit également un déplacement physique postérieur de l’appareil du fuseau par rapport au centre de la cellule, générant ainsi une asymétrie de taille dans les cellules-filles.
Relations Entre les Composants de la Polarité Antéro-Postérieur dans l’Embryon de C. elegans
Le contact entre le centrosome et le cortex rompt la symétrie du zygote et entraîne le retrait de PAR-3/PAR-6/PKC-3 de la partie postérieure d’une manière dépendante de NMY-2. Pendant ce temps, l’enrichissement de PAR-2 à la partie postérieure se produit en même temps que celui de PAR-3/PAR-6/PKC-3 à la partie antérieure. À son tour, PAR-1 empêche l’accumulation de MEX-5/6 au niveau postérieur. La présence de MEX-5/6 à l’avant empêche la présence de granules P et de PIE-1 de ce côté de l’embryon, et renforce également la distribution antérieure de PAR-3/PAR-6/PKC-3. En conséquence de cette séquence d’interactions, les granules P et PIE-1 sont ségrégués vers le postérieur du zygote, contrôlant la position des futures cellules germinales.
Les marqueurs de polarité antéro-postérieure dirigent également le positionnement asymétrique du fuseau mitotique, qui est situé légèrement décentré vers le côté postérieur à la fin de l’anaphase, provoquant ainsi un premier clivage inégal. Ce positionnement asymétrique du fuseau repose sur un complexe conservé au cours de l’évolution qui ancre la dynéine motrice au cortex cellulaire. Chez C. elegans, ce complexe ternaire comprend les protéines associées à la membrane GOA-1 et GPA-16, les protéines GPR-1/2, ainsi que la protéine LIN-5, qui interagit avec la dynéine. La dynéine ainsi ancrée dans le cortex cellulaire exerce une force de traction sur l’extrémité + des microtubules astraux en dépolymérisation et, par conséquent, sur les pôles attachés du fuseau.
Au cours des stades ultérieurs de l’embryogenèse de C. elegans, la plupart des cellules dérivées de AB se divisent symétriquement de manière synchrone, tandis que les descendants de P1 subissent trois divisions asymétriques supplémentaires. Globalement, cela conduit à la génération de sept des cellules fondatrices qui produiront chacune des tissus spécifiques ; par exemple, E donnera naissance à l’intestin et P4 à la lignée germinale. La ségrégation asymétrique des déterminants est également utilisée lors des premiers clivages de l’embryon de C. elegans pour spécifier la lignée germinale et la lignée somatiques. Le zygote subit quatre divisions asymétriques, dont chacune donne naissance à un blastomère somatique plus grand (AB, EMS, C et D) et à un blastomère germinal plus petit (P1, P2, P3 et P4). Au cours de ces divisions, les granules P et les protéines nécessaires au développement de la lignée germinale sont hérités préférentiellement par l’une des 2 cellules-filles. Les granules P sont de gros complexes ribonucléoprotéiques que l’on trouve exclusivement dans la lignée germinale.
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Répartition des Granules P au Cours des Premières Divisions Asymétriques chez C. elegans
L’observation dans le zygote de granules P marqués par fluorescence dans des embryons vivants a révélé que la ségrégation des granules P implique à la fois un mouvement dirigé et une dégradation localisée. Avant le premier clivage, les granules P sont dispersés dans tout le cytoplasme puis migrent vers le pôle postérieur où se formera le blastomère germinatif P1. Les granules P qui restent dans la partie antérieure sont dégradés (ou désassemblés). Le cytosquelette d’actine et plusieurs protéines corticales localisées de manière asymétrique le long de l’axe antéro-postérieur sont nécessaires à la ségrégation des granules P.
Un autre facteur qui sépare la lignée germinale dans les embryons précoces est PIE-1, une protéine codée par la mère nécessaire pour inhiber la transcription de certains ARNm et bloquer ainsi le développement somatique dans les blastomères de la lignée germinale. Comme les granules P, la protéine PIE-1 se trouve initialement dans tout le cytoplasme des embryons nouvellement fécondés et s’enrichit dans le cytoplasme postérieur avant le premier clivage. En conséquence, PIE-1 est présent principalement dans P1 au stade 2 cellules.
Expression de la Protéine Fusion PIE-1-GFP chez C. elegans
On voit que la protéine est exprimée dans les cellules germinales (en haut) et plus tôt au cours du développement elle est spécifiquement présente dans les cellules P1, P2 et P3. Comme de nombreux ARN maternels, l’ARN pie-1 est présent dans tous les blastomères jusqu’au stade 4 cellules. Après le stade de 4 cellules, il est perdu dans les blastomères somatiques et conservé uniquement dans les blastomères de la lignée germinale. Il est donc peu probable que la localisation de l’ARN contribue à la localisation de PIE-1 avant le stade 4 cellules, mais il pourrait être impliqué dans les stades ultérieurs. La traduction localisée de l’ARNm pie-1 pourrait également concentrer PIE-1 dans la lignée germinale. La capacité de PIE-1 à s’associer aux centrosomes pendant la mitose peut contribuer aussi à sa distribution asymétrique. Au début de chaque mitose, PIE-1 s’accumule autour des deux centrosomes du fuseau naissant.
Division Cellulaire Asymétrique dans les Neuroblastes de Drosophile
L’autre modèle abondamment étudié pour examiner la distribution asymétrique des déterminants du destin cellulaire est le neuroblaste de la drosophile, le type cellulaire à l’origine du développement du système nerveux central. Les neuroblastes se divisent de manière asymétrique le long d’un axe apical-basal pour produire un grand neuroblaste apical (auto-renouvellement) et une petite cellule mère ganglionnaire du côté basal (GMC). Bazooka (Baz, l’homologue de Par-3) interagit physiquement avec Par-6 et la protéine kinase atypique C (aPKC), formant le complexe Par, localisé sur la membrane cellulaire apicale du neuroblaste mitotique qui établit un repère apical pour la division asymétrique. aPKC phosphoryle Miranda (Mira) et Numb qui ne peuvent plus s’associer à la membrane plasmique du côté apical et qui forment alors un croissant localisé du côté basal.
Localisation de aPKC au Pôle Apical de Neuroblastes en Mitose
Des coupes d’embryons de drosophile de stade 10 sont traitées en immunofluorescence avec des anticorps reconnaissant aPKC (rouge), Nrt (Neurotactine, un marqueur de la membrane plasmique basolatérale, bleu) et avec un marquage de l’ADN (vert). Les neuroblastes sont indiqués par une étoile.
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Miranda (Mira) se Retrouve au Pôle Opposé d’aPKC dans un Neuroblaste en Division
Neuroblaste observé en immunofluorescence avec un anticorps anti-Mira (rouge), un anticorps anti-aPKC (vert) et une coloration DAPI de l’ADN. Le côté apical est vers le haut et le côté basal vers le bas.
Division Cellulaire Asymétrique dans les Neuroblastes de Drosophile
Les neuroblastes (NBs) se divisent de manière asymétrique pour s’auto-renouveler et pour générer une cellule fille plus différenciée. Le complexe Par (Baz, Par6 et aPKC ; ligne bleue) se localise de manière asymétrique au niveau du cortex apical des NBs. Le complexe Par recrute Inscuteable (Insc, ligne verte), qui recrute à son tour le complexe Pins/Mud/Gαi (ligne orange) au cortex cellulaire apical. Grâce à Mud, ces complexes apicaux orientent le fuseau mitotique par rapport à l’axe apical-basal établi. Par une cascade d’événements de phosphorylation, le complexe apical Par dirige les déterminants du destin cellulaire Numb, Pros et Brat (ligne rouge) vers le cortex cellulaire basal. Lorsque le NB se divise de manière asymétrique, ces déterminants du destin cellulaire sont séparés vers le GMC, où ils favorisent la différenciation plutôt que l’auto-renouvellement.
La polarisation est suivie d’un alignement du fuseau mitotique le long de l’axe de polarité apico-basal, conduisant à une ségrégation asymétrique des déterminants du destin cellulaire. Mira est héritée par la GMC mais pas par le neuroblaste. Elle fonctionne comme une protéine adaptatrice qui lie Prospero (Pros, orthologue du mammifère Prox1), le facteur de transcription à homéodomaine qui contrôle la différenciation de la GMC qui génère deux neurones post-mitotiques ou deux cellules gliales. De son côté, Numb, qui s’accumule aussi du côté basal puis uniquement dans la GMC, facilite l’endocytose du récepteur Notch, conduisant à l’inhibition de la signalisation Notch dans la GMC, ce qui rend possible la différenciation neuronale.
Semblable aux neuroblastes de drosophile, les progéniteurs épidermiques de souris maintiennent le contact avec la membrane basale pour établir la polarité initiale pour leur division. La polarisation de la distribution de Inscutable, LGN, NuMA et dynéine est nécessaire pour diriger l’axe de division.
Complexes qui Lient et Orientent les Microtubules Astraux (et donc le Fuseau Mitotique) à la Membrane Plasmique de Manière Polarisée lors de la Métaphase
Le complexe Par3:Par6:aPKC se localise dans un domaine cortical apical et recrute Insc (l’orthologue de Inscutable) qui se lie directement à Par3. LGN est recruté par ce complexe puis se détache avec Insc pour se lier à la dynéine qui elle-même est reliée aux microtubules astraux (MT). NuMA de son côté interagit aussi avec la dynéine. L’ensemble ancre les microtubules astraux de manière polarisée à une portion particulière de la membrane. L’ancrage des complexes est solidifié par l’afadine liée à l’actine sous-membranaire pour LGN/Insc et par Gα lié au GDP et Dlg pour NuMA. Ric-8 peut destabiliser ce dernier complexe tant que les microtubules astraux ne sont pas proprement alignés avec l’axe requis.
Dans les neuroblastes de drosophile, tout comme d’ailleurs dans les progéniteurs épidermiques de souris, on retrouve les orthologues des protéines PAR que l’on a rencontré lors des premières divisions chez C. elegans. Un domaine Par se forme au niveau du cortex apical pendant la mitose où il empêche l’accumulation de déterminants du destin neuronal, les restreignant au cortex basal. Les domaines corticaux résultants sont coupés en deux par le sillon de clivage conduisant à la ségrégation des déterminants dans la cellule fille basale où ils favorisent la différenciation au détriment de l’auto-renouvellement. Lors des divisions asymétriques, des organelles et des vésicules peuvent se répartir de manière inégale entre les cellules filles.
Répartition Inégale des Gouttelettes Lipidiques lors de la Division de Cellules Souches Neurales et Effet sur la Prolifération
Analyse des divisions cellulaires pour étudier la répartition des gouttelettes lipidiques (LD) après une division dans les cellules souches neurales (NSPC) de la zone sous-ventriculaire (SVZ) de souris adultes. Immunofluorescence avec des anticorps anti-PLIN2 qui est une protéine spécifique des LD (blanc), anti-tubuline qui permet de voir le fuseau mitotique (vert). L’ADN (DAPI) est représenté en bleu. La quantification de la répartition des LD montre qu’un tiers des NSPC en division dans la SVZ distribue les LD de manière asymétrique. Le pourcentage d’asymétrie augmente même jusqu’à la moitié de toutes les cellules lorsqu’on analyse le volume des LD. L’analyse par imagerie time-lapse de cellules filles appariées a révélé une augmentation significative du temps jusqu’à la prochaine division chez la fille qui a hérité asymétriquement moins de LD.
Le Cycle de Vie de la Drosophile : Un Modèle de Choix pour la Génétique
La mouche du vinaigre Drosophila melanogaster est un des modèles les plus anciens utilisés en génétique du développement (et en génétique dans son ensemble). Il y a plus de 100 ans, elle a fourni, par exemple, la preuve définitive que les gènes (alors unités héréditaires « abstraites ») sont portés par les chromosomes. Jusqu’alors, le comportement des chromosomes avait été suivi au cours des divisions cellulaires grâce aux progrès du microscope optique et des techniques de coloration (chromosome = corps colorés), mais leur fonction était inconnue. Ces chromosomes sont particulièrement visibles dans le cas des chromosomes polytènes, présents dans les glandes salivaires des larves. Ils résultent de succession de réplications de l’ADN sans divisions cellulaires (endoréplication). Les bandes observables sur ces chromosomes « géants » ont pu être corrélées avec la présence de tels ou tels caractères héritables.
L’observation très précoce de mutants chez la drosophile a aussi favorisé son choix comme modèle génétique. De plus, l’immense majorité des espèces animales sont des insectes comme la drosophile. Il était donc aussi logique de l’utiliser comme un modèle important en biologie animale. C’est un entomologiste de Harvard, Charles Woodworth qui a été le premier à élever D. melanogaster, juste après le début du XXème siècle.
La drosophile est assez petite (donc facile à élever dans un environnement restreint) : la femelle fait 2,5 mm de long (le mâle est légèrement plus court). Elle n’a besoin que de 9 jours pour passer d’un œuf fécondé à un adulte à 25°C. Une femelle peut produire jusqu’à 100 œufs par jour et jusqu’à 2000 œufs durant toute sa vie. Le développement embryonnaire est très rapide et dure entre 12 et 15 heures à 25°C puis s’ensuit le développement post-embryonnaire avec 3 stades larvaires puis un stade nymphal. La drosophile est en effet un organisme holométabole comme tous les Diptères. La métamorphose dure 4 jours. Le cycle de vie total dure de 10 à 11 jours, ce qui permet d’avoir rapidement des croisements génétiques sur plusieurs générations (notez que ce cette durée de 10/11 jours correspond à l’âge de la première reproduction.
Clivage chez un Embryon de Drosophile
Les premières divisions se produisent dans la région centrale et il n’y a pas de cellularisation (pas de cytodiérèse). Au 10ème cycle cellulaire (stade à 512 noyaux, 2 heures après la fécondation), les cellules polaires se forment dans la partie postérieure (et donneront les cellules germinales). Les autres noyaux et leurs « îlots cytoplasmiques » migrent vers la périphérie de la cellule, générant le blastoderme syncytial. Après le cycle 13, la membrane plasmique issue de celle de l’ovocyte se développe et pénètre entre les noyaux pour former le blastoderme cellulaire (qui est formé d’environ 6.000 cellules). Cette situation permet créer des gradients de concentration de facteurs de transcription qui peuvent diffuser d’un noyau à un autre et avoir un comportement de morphogène. D’habitude, ce sont plutôt des protéines sécrétées qui ont cette propriété et non des facteurs de transcription. Bien que ce soit là une propriété peu commune chez les animaux, cela a amené de grandes avancées conceptuelles.
Gastrulation chez la Drosophile
La gastrulation qui suit permet d’internaliser le mésoderme, l’endoderme ainsi que les cellules germinales. Le mésoderme s’invagine ventralement, tandis que la bande germinale ectodermique réalise la convergence et l’extension. L’endoderme s’invagine là où se trouvent les cellules polaires (PC), à l’extrémité postérieure de la bande germinale.
Thomas Hunt Morgan et la Génétique de la Drosophile
C’est l’américain Thomas Hunt Morgan, qui a commencé à utiliser Drosophila. Morgan, jusque-là, avait fait des expériences sur divers organismes marins (pycnogonides, cténophores) dans le but de comprendre un certain nombre de processus de développement. Il comprit qu’un modèle comme la drosophile avec ses nombreux avantages pouvait apporter un meilleur éclairage sur le développement tout en élucidant quelques problèmes génétiques fondamentaux. Par des croisements, Morgan s’est rendu compte qu’il s’agit d’une mutation récessive et que la transmission de ce gène est liée au sexe, ce qui l’a amené à postuler qu’il se trouve sur le chromosome X (l’analyse de ses croisements excluait qu’il puisse se trouver sur le chromosome Y). Bien plus tard, cela a été confirmé par séquençage du génome.
Le Génome de la Drosophile : Un Outil Puissant pour la Recherche
Le génome de la drosophile, entièrement séquencé en l’an 2000, est beaucoup plus petit que celui des vertébrés-environ 140 millions de paires de bases, contre 3.200 millions pour un Humain (plus de 20 fois plus !). Il est réparti sur 4 chromosomes (ou paires de chromosomes si on considère la diploïdie ; il y a 3 paires de chromosomes autosomes et une paire de chromosomes sexuels). Ce génome code environ 15 600 protéines. Sa densité génique est nettement plus importante que chez l’Homme : on compte en moyenne 80 gènes par mégabase (1 million de bases) chez la drosophile contre 6 chez l’Homme. Les mutants peuvent désormais être obtenus pour pratiquement n’importe quel gène. Relativement à chez l’Homme, les familles multigéniques sont assez réduites chez la drosophile, ce qui facilite les analyses fonctionnelles (peu ou pas de redondances). On dénombre plus de 160.000 génotypes différents publiés chez la drosophile (il peut y avoir plusieurs mutations par gène) !
La Transgénèse chez la Drosophile : Un Atout Majeur
La transgénèse chez la drosophile consiste à insérer une séquenced’ADN connue dans l’ADN chromosomique en utilisant comme vecteur un élément transposable (transposon). Ce transposon est connu sous le nom d’élément P. Les éléments P peuvent s’insérer dans n’importe quel site du génome et peuvent aussi se transposer d’un site à un autre dans les cellules germinales, une action qui réclame la présence d’une enzyme appelée transposase. Comme ce mécanisme est susceptible de générer de l’instabilité génomique, on a retiré aux éléments P servant de vecteur de transgénèse le gène codant la transposase. La transposase nécessaire à l’insertion initiale de l’élément P est fournie par un élément P dit « helper », qui ne peut pas s’insérer dans le génome, et est donc rapidement éliminé. Les éléments P « vecteur » et « helper » sont injectés ensemble dans la partie postérieure de l’œuf où se forment les cellules germinales. En plus du gène à insérer, l’élément P modifié porte un gène marqueur tel que l’allèle sauvage du gène white. Dans ce cas, l’élément P est inséré chez des mouches homozygotes pour l’allèle mutant white- (qui ont des yeux blancs à la place des yeux rouges habituels de la drosophile sauvage).
Un système basé sur la spécificité de l’activité des promoteurs et utilisant la transgénèse permet de ne faire exprimer un gène d’intérêt ou un gène rapporteur que dans les cellules où un promoteur est actif.
Le Système FLP-FRT : Pertes et Gains de Fonctions
Chez la drosophile, des pertes et des gains-de-fonctions peuvent être obtenus grâce au système FLP-FRT. FLP (ou flippase) est une recombinase de levure qui est capable de recombiner deux séquences FRT (pour Flippase Recognition Target) et de déléter les séquences qui se trouvent entre deux séquences FRT.
Les Prix Nobel et la Drosophile
L’utilisation de la drosophile comme organisme modèle a été couronnée par 4 prix Nobel de Médecine : Thomas Hunt Morgan, qui a reçu le prix Nobel de physiologie ou de médecine en 1933 pour « ses découvertes concernant le rôle joué par le chromosome dans l’hérédité ». L’élève de Morgan, Herman J Muller, a ensuite reçu le prix en 1946 « pour la découverte de la production de mutations par irradiation aux rayons X ». En 1995, les chercheurs sur la drosophile, Edward B Lewis, Christiane Nüsslein-Volhard et Eric Wieschaus ont partagé le prix « pour leurs découvertes concernant le contrôle génétique du développement embryonnaire précoce ».
Régulations Traductionnelles : Un Rôle Essentiel
Les régulations traductionnelles sont essentielles pendant l'ovogenèse et le développement précoce. Ces régulations sont cruciales pour la biologie des cellules souches germinales et pour l'embryogenèse précoce qui dépend d'ARNm maternels et de leur régulation. Un mécanisme majeur de régulation traductionnelle implique les variations de la taille des queues poly(A) des ARNm qui régulent la stabilité et la traduction des ARNm. L'élongation des queues poly(A) conduit à l'activation traductionnelle, tandis que le raccourcissement des queues poly(A) conduit à la dégradation des ARNm ou à la répression traductionnelle. Chez la drosophile, la polyadénylation cytoplasmique et la déadénylation jouent un rôle essentiel dans la formation des axes embryonnaires en contrôlant la production de déterminants majeurs du patterning de l'embryon.
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