Introduction
Les cellules souches pluripotentes, notamment les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules pluripotentes induites (iPSC), offrent des perspectives prometteuses en médecine régénérative. Ces cellules ont la capacité de se différencier en divers types cellulaires, ce qui suscite un intérêt considérable pour le remplacement des cellules défaillantes dans des maladies telles que le diabète. Le développement du pancréas est un processus complexe impliquant de nombreux facteurs de croissance. Comprendre ce processus est essentiel pour guider la différenciation des CSE/iPSC en cellules pancréatiques. Cet article explore l'effet du chlorure de lithium (LiCl) sur le développement embryonnaire, en mettant en évidence son rôle dans la mise en place de l'organisateur de Spemann et ses implications pour la différenciation cellulaire.
Développement du pancréas : un processus complexe et séquentiel
Le développement du pancréas est un processus complexe et séquentiel, avec l’intervention de nombreux facteurs de croissance issus des structures avoisinantes ou du pancréas lui-même. Il serait utopique de penser à une intégration compléte de toutes ces informations dans la différenciation des ESC/iPSC en cellules pancréatiques, mais ses grandes lignes permettent actuellement de générer des progéniteurs pancréatiques de manière assez efficace. En se fondant sur les connaissances du développement embryonnaire du pancréas, des efforts ont été mis en œuvre pour initialement produire la couche germinale dont il est le dérivé, l’endoderme définitif (DE, definitive endoderm).
Facteurs de croissance impliqués dans le développement du pancréas
Le développement du pancréas est un processus complexe et séquentiel, avec l’intervention de nombreux facteurs de croissance issus des structures avoisinantes ou du pancréas lui-même. Ces facteurs comprennent : HB-EGF (heparin binding epidermal growth factor) ; HGF (hepatocyte growth factor) ; VEGF (vascular endothelial growth factor) ; BMP (bone morphogenetic protein) ; FGF (fibroblast growth factor) ; TGF (transforming growth factor).
Production de l'endoderme définitif
À la suite des travaux réalisés un an auparavant avec les ESC de souris, D’Amour et al. ont mis au point un protocole de différenciation des ESC humaines en endoderme définitif (DE) qui consistait en une stimulation par l’activine A (ActA), un membre de la famille TGFβ. La voie de signalisation induite par l’ActA s’est révélée incontournable dans la dérivation de l’endoderme définitif à partir de différentes lignées ESC et iPSC. Il a été récemment démontré qu’au cours de l’induction de l’endoderme définitif, l’utilisation du sérum animal peut être abandonnée et remplacée par une stimulation temporelle de la voie MAPK (mitogen-activated protein kinase) par du FGF2.
Les cellules souches pluripotentes : un espoir pour la médecine régénérative
Les cellules souches pluripotentes sont actuellement représentées par deux grands groupes : les cellules souches embryonnaires (ESC, embryonic stem cells) et les cellules pluripotentes induites (iPSC, induced pluripotent stem cells). Ces deux propriétés sont à la base de l’intérêt accordé de nos jours à la différenciation guidée de cellules souches en cellules différenciées fonctionnelles capables de remplacer les cellules défaillantes dans diverses maladies humaines, y compris le diabète sucré au cours duquel les cellules β sécrétrices d’insuline sont détruites dans le pancréas (diabète de type 1) ou fonctionnellement insuffisantes (diabète de type 2).
Lire aussi: Indications de l'amoxicilline infantile
Défis et perspectives de la différenciation in vitro
Cependant, malgré ces véritables avancées, il n’est toujours pas possible d’induire la différenciation de cellules β fonctionnelles in vitro, bien que celles-ci ont été obtenues in vivo après transplantation de progéniteurs chez la souris. C’est dire que les prérequis élémentaires pour une différenciation des cellules du lignage pancréatique sont actuellement connus et implémentés in vitro pour efficacement produire des progéniteurs pancréatiques.
L’expression de Pdx1 étant plus étendue que le domaine pancréatique, c’est uniquement sa combinaison avec d’autres facteurs (Nkx6.1, Ptf1a [pancreas transcription factor 1a], Sox9 [(sex determining region y)-box 9], Hnf6 [hepatocyte nuclear factor 6] et Foxa2 [forkhead box A2]) qui définit le progéniteur pancréatique de manière indéniable. Les travaux récents cherchent à démontrer la nature pancréatique des cellules PDX1-positives dérivées des ESC/iPSC en les marquant en plus avec un anticorps dirigé contre l’un des autres facteurs. La difficulté à obtenir in vitro des cellules β fonctionnelles, à l’instar de celles qui existent dans le pancréas humain, traduit le manque de connaissances exactes sur les dernières phases du développement des cellules endocrines du pancréas, ce qui va de pair avec la cinétique du développement embryonnaire humain.
Influence du site de transplantation
L’expérience dans ce domaine montre que le site de transplantation peut avoir une influence considérable sur le devenir des cellules implantées, et que l’espace sous-cutané offre des avantages bénéfiques pour une application clinique.
Marqueurs de surface pour la sélection des progéniteurs pancréatiques
Les modèles de différenciation actuels ne permettent pas la production de cultures homogènes de progéniteurs pancréatiques. Des cellules non ou peu différenciées persistent et sont parfois initiatrices de tératomes après leur transplantation in vivo. La sélection de progéniteurs pancréatiques ou de cellules β devra donc représenter un axe majeur de recherche pour les prochaines années, et le succès dans ce domaine dépendra de l’existence de véritables marqueurs de surface spécifiques à ces cellules.
Molécules de synthèse dans la génération de progéniteurs pancréatiques
La différenciation des ESC/iPSC en cellules pancréatiques se base sur le modèle de développement embryonnaire et utilise principalement des protéines recombinantes pour activer ou bloquer les récepteurs exprimés par les cellules en culture. Au contraire des protéines recombinantes, les molécules de synthèse sont en général bon marché et leur stabilité est acceptable. Au cours des dernières années, quelques plate-formes de criblage de molécules de synthèse ont été mises sur pied, et les efforts consentis ont permis l’identification des composés qui activent ou inhibent les mêmes voies de signalisation que certaines protéines recombinantes. Tel est le cas de l’IDE1 et de l’IDE2 (inducer of definitive endoderm-1 et -2) qui permettent de dériver l’endoderme définitif à partir des ESC/iPSC en stimulant les effecteurs SMAD2/3 de la voie TGFβ. Pour induire la différenciation des ESC/iPSC en progéniteurs pancréatiques et endocriniens, usage est fait de plusieurs molécules de synthèse dont la cyclopamine (inhibiteur de la voie Hedgehog), la dorsomorphine (inhibiteur de BMP), le SB431542 (inhibiteur de la voie TGFβ), l’inhibiteur de la FAK (focal adhesion kinase) et l’(-)-indolactam V. Même si les données de la littérature montrent que les cellules pancréatiques n’ont pas encore été dérivées dans une « soupe chimique » au sens propre, les efforts actuels devraient porter sur des systèmes utilisant le plus de molécules de synthèse et le moins de protéines recombinantes possible pour induire la différenciation de ces précurseurs pancréatiques.
Lire aussi: Alternatives au Tylenol pour soulager la douleur des nourrissons
Rôle de LiCl dans le développement embryonnaire
Le chlorure de lithium (LiCl) est connu pour ses effets dorsalisants et antériorisants sur les embryons. L'incubation d'embryons dans une solution de LiCl au stade 32 cellules a des effets dorsalisants (et antériorisants). Il agit en inhibant l'activité de GSK3β, une kinase impliquée dans la dégradation de la β-caténine. En inhibant GSK3β, LiCl favorise l'accumulation de β-caténine dans le noyau, ce qui entraîne l'activation de gènes impliqués dans la formation de l'organisateur de Spemann.
L'organisateur de Spemann et l'axe dorso-ventral
L'organisateur de Spemann est une structure essentielle pour la mise en place de l'axe dorso-ventral chez les vertébrés. Il sécrète des inhibiteurs de signaux inducteurs tels que BMP, Wnt et Nodal. En inhibant ces signaux, l'organisateur de Spemann permet la formation du tissu neural dorsal.
Mécanismes d'action de LiCl
LiCl influence plusieurs voies de signalisation clés impliquées dans le développement embryonnaire, notamment :
- Voie Wnt/β-caténine : LiCl inhibe GSK3β, ce qui entraîne l'accumulation de β-caténine et l'activation de gènes cibles de la voie Wnt.
- Voie BMP : L'organisateur de Spemann sécrète des antagonistes de BMP tels que Chordine et Noggin, qui inhibent l'activité de BMP et favorisent la formation du tissu neural dorsal.
LiCl et développement musculaire squelettique
Le muscle strié squelettique est un tissu contractile qui occupe environ 40 % du poids d’un humain et qui est distribué dans tout le corps. Chez l’homme, une des dysfonctionnements musculaires entraînent une grande variété de troubles physiologiques, allant des crampes musculaires courantes aux myopathies sévères. Le muscle squelettique a des propriétés fonctionnelles hétérogènes qui sont spécifiques pour un type de muscle. Les muscles des membres et du tronc interviennent dans la posture du corps, la locomotion et la respiration, tandis que les muscles craniofaciaux contrôlent principalement l’expression faciale, la parole, l’activité alimentaire et le mouvement des yeux. La plupart des muscles squelettiques du tronc et des membres sont dérivés de cellules précurseurs myogéniques ou myoblastes qui migrent à partir des somites au cours du développement embryonnaire tandis que la musculature de la tête, provient principalement du mésoderme céphalique et aussi des cellules de crêtes neurales (il n’y a de toute manière pas de somites dans la tête).
Du mésoderme aux cellules musculaires striées squelettiques
La musculature du corps (en excluant la tête) est constituée d’une composante épaxiale et hypaxiale. La composante épaxiale est composée des muscles profonds du dos qui proviennent directement du myotome sans migration de cellules. La composante hypaxiale comprend les muscles de la paroi ventrolatérale du corps, des ceintures, des membres et de la langue. Les cellules des muscles des membres et de la langue et des muscles latéraux de la ceinture scapulaire sont dérivées des myoblastes qui ont migré à partir du somite. En revanche, les muscles de la paroi corporelle ventrolatérale (muscles intercostaux et abdominaux) et les muscles de la ceinture scapulaire médiale sont formés directement à partir du myotome, sans migration. Au cours de la différenciation, les myoblastes s’alignent et fusionnent en une unité fondamentale : la fibre musculaire.
Lire aussi: Définitions, causes et informations : retour de couches et fausse couche
Organisation d’un sarcomère
La machinerie contractile des cellules musculaires striées est basée sur un impressionnant réseau de filaments minces (à base d’actine) et épais (à base de myosine), disposés en unités répétitives, les sarcomères qui font 2 µm de longueur environ. Chaque sarcomère peut être divisé axialement en différentes zones en fonction de son ultrastructure : la bande I (isotrope) où seuls des filaments fins d’actine sont présents, la bande A (anisotrope) qui contient des filaments d’actine et les filaments épais de myosine qui se chevauchent, le disque Z qui borde le sarcomère à ses extrémités, ancrant les extrémités barbelées (+) des filaments d’actine, et la bande H au centre, où seuls les filaments de myosine sont présents et réticulés.
Développement de dermomyotome et détermination des muscles squelettiques
Peu de temps après leur formation, les somites se subdivisent en sclérotome mésenchymateux ventral (qui donne les vertèbres) et en dermomyotome épithélial dorsal. Ce dernier compartiment contient des progéniteurs des cellules musculaires striés squelettiques, les myoblastes (aux côtés du derme et de la graisse brune) et maintient l’expression de Pax3 contrairement au sclérotome (qui se met à exprimer Pax1). La structuration appropriée des somites et du dermomyotome puis du myotome repose sur plusieurs voies de signalisation telles que FGF, WNT et SHH qui ont été identifiées dans des études complémentaires réalisées sur des embryons de souris, de poulet et de poisson zèbre. Ces voies de signalisation convergent pour faire exprimer Pax3 et ensuite pour enclencher le programme myogénique. Notamment, Wnt1 et Wnt3a, produits dans le tube neural dorsal, adjacent au site de la myogenèse épaxiale, activent préférentiellement l’expression de Myf5 tandis que Wnt6 et Wnt7a, produits dans l’ectoderme dorsal, induisent préférentiellement l’expression de MyoD. En effet, en l’absence de Pax3, les cellules du dermomyotome subissent une apoptose.
Régulations génétiques et facteurs de régulations myogéniques
En plus de son rôle de facteur de transcription, Pax3 est impliqué dans le remodelage de l’accessibilité de la chromatine au niveau des loci myogéniques. Le développement du lignage musculaire est ensuite contrôlé par les MRF ou les facteurs de régulations myogéniques incluant MYF5, MYOD, myogénine (MYOG) et MRF4 (également connu sous le nom de Myf6). Ils font partie de la famille des facteurs de transcription hélice-boucle-hélice, qui se lient aux séquences spécifiques appelées boîtes E (E-box) trouvés dans de nombreux promoteurs de gènes impliqués dans la myogenèse. Les MRF sont connus pour leur capacité à convertir les cellules non myogéniques en cellules musculaires en activant l’expression des gènes spécifiques du muscle. Myf5 et MyoD et dans une moindre mesure Mrf4 sont des facteurs importants pour la détermination myogénique, tandis que la myogénine est induite plus tard dans la différenciation et est nécessaire au développement du muscle mature.
Mise en place des axes des vertébrés
Les Vertébrés font partie des Bilatériens et ils ont à ce titre 3 axes : antéro-postérieur (AP), dorso-ventral (DV) et droite-gauche. Ils font partie des Chordés, donc ce sont des Epineuriens : leur système nerveux central est entièrement dorsal et formé à partir d’un tube neural produit au cours de la neurulation. La structure fondamentale qui coordonne la mise en place des axes des vertébrés s’appelle l’organisateur de Spemann qui correspond à la lèvre dorsale du blastopore chez les Amphibiens et au nœud de Hensen chez les Amniotes. Il a souvent été présenté dans son rôle de mise en place de l’axe DV mais il est également important pour l’axe AP et l’asymétrie droite/gauche.
L'expérience de Spemann et Mangold
L’expérience de Spemann et Mangold réalisée en 1924 est une des expériences fondatrices de la biologie du développement. Elle consiste en la greffe de la lèvre dorsale du blastopore d’une jeune gastrula d’amphibien sur la région ventrale d’un autre amphibien. On obtient alors un embryon puis une larve qui possède deux axes dorsaux c’est-à-dire deux tubes neuraux, deux cordes, deux séries de somites. Donc, tandis que la lèvre dorsale du blastopore greffée s’est développée en corde, elle a induit les tissus ventraux alentour à donner du tissu nerveux et des somites. Sans ces signaux, les tissus ventraux auraient donné de l’épiderme et du mésoderme ventral (cellules sanguines par exemple).
Rotation corticale et accumulation de β-caténine
Ces évènements sont liés à la rotation corticale qui suit la fécondation où le cytoplasme du zygote juste sous la membrane plasmique se déplace d’un angle de 30° vers le point d’entrée du spermatozoïde. L’une des protéines déplacées est Dishevelled qui est accrochée à des vésicules transportées le long de faisceaux parallèles de microtubules. Dishevelled protège du côté dorsal la β-caténine de la destruction induite par GSK3β. β-caténine s’accumule alors sur la face dorsale de l’embryon et entre dans le noyau au stade 16 cellules. Elle s’associe aux facteurs de transcription LEF/TCF.
Gradient de Xnr et centre de Nieuwkoop
La région de la zone marginale proche des blastomères végétatifs dorsaux reçoit plus de Xnr et sont induits en mésoderme dorsal, qui donne naissance à l’organisateur de Spemann. Les blastomères végétatifs qui expriment le plus de Xnr correspondent au centre de Nieuwkoop, un centre caractérisé par sa capacité à induire un organisateur de Spemann. Les blastomères végétatifs ventraux qui secrètent moins de Xnr induisent du mésoderme ventral (et donc pas l’organisateur de Spemann). D’autres expériences montrent que c’est l’absence d’entrée de la β-caténine dans le noyau du côté dorsal qui est à l’origine de l’absence d’activation de l’expression de Xnr5 et de Xnr6. Par ailleurs, VegT est également impliqué dans l’activation de l’expression de ces gènes.
Le bouclier embryonnaire du poisson-zèbre
La β-caténine maternelle joue un rôle important dans la formation du bouclier et de l’axe DV chez le poisson zèbre. La β-caténine maternelle active la transcription de gènes spécifiques dorsaux, notamment squint, goosecoid, bozozok et chordin (chd), induisant ainsi la formation de l’organisateur de Spemann. Contrairement au xénope, ce n’est pas Wnt11 mais Wnt8a qui contribue à activer la voie Wnt/β-caténine du côté dorsal.
Induction du tissu neural par le nœud de Hensen
Chez les embryons de poulet, les signaux qui induisent le nœud de Hensen (=l’organisateur de Spemann des Amniotes) sont actifs assez longtemps, car on peut enlever un nœud de Hensen et un autre se développera à la place. On peut différencier un organisateur de Spemann à partir de cellules souches pluripotentes humaines en présence de Wnt et d’activine.
Inhibition des signaux inducteurs par l'organisateur de Spemann
A la surprise générale, la découverte des molécules sécrétées par l’organisateur de Spemann a révélé que c’est une structure qui inhibe toute une série de signaux inducteurs (BMP, Wnt et Nodal). Ainsi, l’organisateur de Spemann sécrète des antagonistes de BMP tels que Chordine et Noggin, des antagonistes de Wnt tels que Dkk1, Frzb1 et Crescent, et des inhibiteurs multivalents comme Cerberus.
Rôle de la chordine dans la formation de l'axe dorso-ventral
L’injection de l’ARNm de chordine rétablit les axes d’un embryon traité aux UV, sans rotation corticale. Juste avant la gastrulation, l’activité BMP (qui peut s’observer en étudiant la phosphorylation des transducteurs de sa voie Smad1, Smad5 et Smad8) établit un gradient ventral haut à dorsal bas, et une faible activité BMP sur la face dorsale permet aux cellules ectodermiques d’acquérir un destin neural, tandis que les autres cellules ectodermiques prennent le destin de l’épiderme. Chordine sécrétée par l’organisateur de Spemann s’oppose à l’activité BMP4 en se liant aux BMP et en les empêchant d’atteindre leur récepteur ce qui favorise les destins dorsaux. Chordine et BMP diffusent dans l’espace extracellulaire et forment des gradients d’activité opposés dans l’embryon.
tags: #effet #licl #embryon #développement