Introduction
Comprendre les mécanismes qui régulent le positionnement du noyau et déchiffrer les informations que ce positionnement véhicule constituent un axe de recherche majeur en biologie de la reproduction et du développement. Chez de nombreuses espèces, la position du noyau à la fin de la croissance ovocytaire prédéfinit les axes du futur embryon. Ainsi, chez les nématodes, les oursins, le xénope et le poisson-zèbre, le noyau de l'ovocyte marque le pôle animal, qui instruira les futurs axes de l'embryon. Chez la drosophile, il définit l'axe dorso-ventral de l'embryon.
Cependant, ce n'est pas le cas chez les mammifères, où le noyau est parfaitement centré à la fin de la croissance ovocytaire dans l'ovaire. Ce centrage du noyau est d'autant plus surprenant que les ovocytes subissent ensuite deux divisions extrêmement asymétriques, avec un décentrage de leurs chromosomes. Plus étonnant encore, chez les ovocytes de souris et d'humains, il existe une corrélation entre le centrage du noyau et le succès des divisions méiotiques.
Centrage du Noyau de l'Ovocyte : Un Processus Essentiel
Un Gradient de Pression Dépendant de l'Actine
L'ovocyte de souris, une grande cellule sphérique de 80 μm, ne possède pas les caractéristiques (centrosomes et microtubules associés, cortex différencié) qui permettent normalement la polarisation, la définition de son centre géométrique et le positionnement du noyau. Cependant, il parvient à centrer parfaitement son noyau, dont la taille est comparable à celle d'une cellule somatique (30 μm).
Des travaux antérieurs ont mis en évidence un mode original de centrage du noyau de l'ovocyte, qui dépend uniquement du cytosquelette d'actine et non des microtubules, contrairement à de nombreux autres types de cellules. Les ovocytes invalidés pour le nucléateur d'actine Formine 2 (Fmn2−∕−), un gène maternel essentiel, présentent des noyaux excentrés. La réintroduction de Formine 2 permet la formation d'un réseau d'actine dans le cytoplasme et provoque le centrage du noyau, de manière extrêmement robuste : tous les ovocytes ont leur noyau centré en 6 heures. Ce centrage dépend du moteur moléculaire d'actine, la Myosine Vb, qui génère la dynamique du réseau d'actine.
Le rôle de la Myosine Vb est double : elle crée un gradient dans l'activité du réseau d'actine, qui diminue du cortex vers le centre, analogue à un gradient de pression qui génère une force qui pousse le noyau de manière non spécifique vers le centre ; elle fluidifie également le cytoplasme par advection, créant un mouvement global de tous les organites cytoplasmiques, d'où un environnement propice au mouvement de gros objets tels que le noyau.
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Ce mécanisme détecte principalement la taille des objets. Ainsi, tout objet suffisamment grand peut être transporté sur de longues distances, ce qui est très avantageux dans le cas de grandes cellules comme les ovocytes.
La robustesse de ce nouveau mécanisme de centrage du noyau a conduit à interroger son rôle physiologique dans des aspects orientés vers la biologie de la reproduction et du développement.
Impact sur la Position et l'Architecture du Noyau
Les ovocytes invalidés pour la Formine 2 ont des noyaux excentrés et présentent également des noyaux déformés par rapport aux noyaux témoins. Ils présentent systématiquement une invagination et leur chromatine apparaît moins condensée. Ces défauts combinés tendent à augmenter les contacts entre l'enveloppe nucléaire et la chromatine, contacts qui sont habituellement rares dans les ovocytes en fin de croissance.
Une approche de biologie computationnelle a permis de reconstruire les noyaux à partir d'images acquises en 3D. Cette approche a permis d'identifier, de manière non biaisée, des paramètres permettant de décrire quantitativement l'architecture des noyaux d'ovocytes et ainsi de distinguer différentes catégories de noyaux sur la seule base de ces paramètres. De cette manière, les variations d'architecture nucléaire entre différentes conditions (témoins, Fmn2−∕−, Fmn2−∕− dans lesquels l'ensemble de la Formine 2 ou son domaine de nucléation d'actine FH1FH2 a été réintroduit) ont pu être quantifiées avec précision.
Ainsi, la réintroduction de Formine 2 permet d'induire le centrage du noyau et de restaurer complètement la forme et l'architecture nucléaires. La réintroduction du seul domaine de nucléation d'actine de Formine 2 restaure une grande partie de cette architecture, ce qui montre que le réseau d'actine cytoplasmique a une contribution majeure dans le maintien de la forme et de l'architecture du noyau de l'ovocyte.
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Fluctuations de l'Enveloppe Nucléaire et Mouvement de la Chromatine
L'observation des noyaux à haute résolution temporelle via la microscopie vidéo d'une sonde nucléaire a révélé la nature hautement dynamique de l'enveloppe nucléaire, qui est soumise à de fortes fluctuations en amplitude et en fréquence.
Ces observations ont confirmé les défauts d'architecture nucléaire observés précédemment en 3D sur des ovocytes fixés : les noyaux témoins adoptent une forme régulière tandis que les noyaux Fmn2−∕− ou d'ovocytes traités avec un médicament dépolymérisant l'actine sont asymétriques, principalement lisses et inactifs sur 2/3 de leur surface, et présentant une invagination où des fluctuations locales se produisent, correspondant au 1/3 restant.
Le rôle des microtubules dans la dynamique du noyau a également été clarifié : ils aident à stabiliser l'enveloppe nucléaire. En leur absence (traitement avec un médicament induisant la dépolymérisation des microtubules), les fluctuations de l'enveloppe sont amplifiées.
L'origine de l'invagination observée dans les noyaux d'ovocytes dépourvus de réseau d'actine cytoplasmique (Fmn2−∕− ou traités avec un médicament) a été déterminée. Elle correspond à la présence d'un centre majeur d'organisation des microtubules (MTOC) à partir duquel les microtubules contactent et déforment localement l'enveloppe.
Une analyse fréquentielle des fluctuations de l'enveloppe nucléaire a permis d'établir un modèle des propriétés mécaniques de l'enveloppe nucléaire. Ce modèle a permis de vérifier que les différences dans l'étendue des fluctuations entre les noyaux de témoins, de Fmn2−∕− et de témoins traités avec un médicament dépolymérisant l'actine, proviennent bien des forces cytoplasmiques et de la dynamique du réseau d'actine. Ces différences ne sont pas dues à des différences intrinsèques dans les propriétés mécaniques de l'enveloppe.
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Afin d'étudier l'impact des fluctuations de l'enveloppe nucléaire à l'intérieur du noyau, le mouvement de la chromatine a été surveillé par microscopie vidéo à la même résolution temporelle que celle déterminée pour l'étude des fluctuations de l'enveloppe nucléaire.
Une réduction significative de l'amplitude du mouvement de la chromatine a été observée dans les ovocytes dépourvus de réseau d'actine cytoplasmique (Fmn2−∕− ou traitement avec un médicament). Des expériences de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), permettant de mesurer la diffusion de protéines fluorescentes, sur la sonde nucléaire, qui diffuse indépendamment de la chromatine, ont permis d'exclure une différence potentielle de viscosité à l'intérieur des noyaux témoins et Fmn2−∕−. Cela suggère que la différence de dynamique de la chromatine dépend strictement de l'amplitude des fluctuations de l'enveloppe nucléaire. De plus, une corrélation entre la proximité de la chromatine avec l'enveloppe nucléaire et l'amplitude du mouvement a pu être établie.
Ainsi, les fluctuations de l'enveloppe nucléaire sont transmises à l'intérieur du noyau, bien qu'avec dissipation d'énergie, et affectent la dynamique des objets à l'intérieur du noyau, tels que la chromatine.
Modulation de l'Expression Génique par les Fluctuations
Afin de déterminer si cette dynamique différentielle de la chromatine a des conséquences sur l'expression génique, une étude comparative de séquençage d'ARN (RNA seq) a été réalisée entre des ovocytes témoins et Fmn2−∕−. Cette étude transcriptomique a révélé 256 gènes différemment exprimés dans Fmn2−∕− (244 sous-exprimés et 12 surexprimés).
La plupart de ces gènes correspondent à des protéines codantes et une analyse approfondie de leur localisation chromosomique a révélé qu'ils étaient répartis uniformément dans le génome, ce qui est cohérent avec un effet global des fluctuations de l'enveloppe impactant le génome dans toutes les directions.
Afin de vérifier si ces gènes étaient effectivement sensibles au centrage du noyau, le niveau d'expression des gènes les plus significativement dérégulés a été analysé dans des ovocytes dont le noyau a été recentré. Cela a montré que la réintroduction de Formine 2 dans des ovocytes Fmn2−∕− restaure partiellement les niveaux d'expression de quelques gènes qui ont été testés.
Une analyse croisée de la liste des gènes dérégulés avec les données des LADs et des compartiments dans les cellules ES montre une localisation préférentielle de ces gènes dans les domaines actifs de la chromatine (interLADs constitutifs, qui sont des régions jamais associées aux Lamines dans un panel de différents types de cellules et compartiments A). Ceci est cohérent avec une récupération partielle des niveaux d'expression des gènes dépendant de l'activité transcriptionnelle, puisqu'elle n'a pas été observée en présence d'inhibiteurs de la transcription. Ces résultats ont également conduit à reconsidérer le dogme d'un arrêt total de l'activité transcriptionnelle à la fin de la croissance ovocytaire, complémentaire aux découvertes dans les ovocytes de drosophile. En effet, il a été prouvé l'existence de loci transcriptionnels persistants dont l'activité dépend de la présence du réseau d'actine dans les ovocytes de souris pleinement développés.
Enfin, l'absence de filaments d'actine dans le noyau et les niveaux comparables d'actine monomérique dans les noyaux des ovocytes témoins et Fmn2−∕− permettent d'exclure une contribution de l'actine nucléaire dans ces processus.
Conclusion
Ce travail collaboratif entre biologistes, biophysiciens théoriques et statisticiens a permis de mieux comprendre le lien entre le centrage du noyau et le succès des divisions méiotiques. Le même phénomène physique qui centre le noyau de l'ovocyte génère un type unique de processus de mécano-transduction dans lequel la dynamique du réseau d'actine dans le cytoplasme agite le noyau en "massant" activement sa surface. Ce processus permet la transmission de forces du cytoplasme à l'intérieur du noyau, contrôlant la transcription d'un certain ensemble de gènes.
Les divisions méiotiques ainsi que les premiers stades du développement embryonnaire se produisent à de très faibles niveaux de transcription, d'où le succès des premiers stades du développement embryonnaire dépend strictement de la quantité d'ARNm maternels accumulés dans l'ovocyte. Cette quantité est impactée en l'absence du processus de mécano-transduction provenant du cytoplasme. Ainsi, en modulant finement les réserves d'ARNm maternels, le centrage du noyau est prédictif de la qualité du gamète femelle et de son potentiel de développement après la fécondation.
Clivage et Développement Embryonnaire Précoce
Clivage : Divisions Cellulaires Initiales
Le clivage est la première étape du développement embryonnaire, au cours de laquelle le zygote, puis l'embryon, subissent des mitoses successives, divisant le cytoplasme issu de l'ovocyte. Le type de clivage varie selon les espèces :
- Clivage en spirale : Caractérisé par une rotation de 45° du fuseau mitotique, observé chez les Annélides, les Mollusques et les Plathelminthes.
- Clivage radiaire :
- Clivage holoblastique (total) : L'ensemble du volume de l'ovocyte est cellularisé, observé chez les amphibiens. Les premières divisions sont méridiennes, divisant le zygote en blastomères. Le troisième plan de division est équatorial, générant des micromères (pôle animal) et des macromères (pôle végétatif).
- Clivage méroblastique (partiel) : Ne concerne qu'une petite région du volume de l'ovocyte, le reste étant occupé par le vitellus, observé chez les oiseaux.
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