Introduction
Le test de lactate déshydrogénase (LDH) est une méthode colorimétrique permettant de mesurer quantitativement l'activité de la LDH, une enzyme cytosolique stable libérée lors de la lyse cellulaire. Ce test est une alternative non radioactive aux tests de cytotoxicité traditionnels, tels que ceux utilisant le [51Cr]. Le test de cytotoxicité non radioactif CytoTox 96® de Promega est basé sur cette méthode. Il est largement utilisé pour évaluer la cytotoxicité induite par divers agents et pour déterminer le nombre total de cellules. Cet article détaille le protocole, les applications et les considérations importantes pour la réalisation de ce test.
Principe du Test CytoTox 96®
Le test CytoTox 96® repose sur la mesure de la LDH libérée dans le surnageant de culture. Cette LDH catalyse une réaction enzymatique couplée qui convertit un sel de tétrazolium (INT) en un produit formazan rouge. L'intensité de la couleur formée est directement proportionnelle au nombre de cellules lysées. L'absorbance est mesurée à une longueur d'onde visible à l'aide d'un lecteur de plaques standard à 96 puits.
Protocole du Test LDH Promega
Matériel Nécessaire
- Kit CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay de Promega
- Lecteur de plaques à 96 puits standard
- Plaques de culture à 96 puits
- Cellules cibles
- Agents cytotoxiques (si applicable)
- Milieu de culture approprié
Étapes du Protocole
- Préparation des Cellules :
- Cultiver les cellules cibles dans un milieu approprié.
- Préparer des suspensions cellulaires à la concentration désirée.
- Incubation avec les Agents :
- Répartir les cellules dans les puits de la plaque de culture.
- Ajouter les agents cytotoxiques à différentes concentrations, selon le besoin.
- Incuber les cellules pendant la durée appropriée (par exemple, 4 heures).
- Réaction Enzymatique :
- Après l'incubation, transférer une partie du surnageant de chaque puits vers une nouvelle plaque.
- Ajouter le réactif CytoTox 96® (contenant le sel de tétrazolium INT) à chaque puits.
- Incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
- Lecture de l'Absorbance :
- Ajouter la solution de stop pour solubiliser le produit formazan.
- Mesurer l'absorbance à 490 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.
Optimisation du Protocole
- Type de Plaque : Utiliser des plaques à parois transparentes pour une lecture optimale de l'absorbance.
- Densité Cellulaire : Optimiser la densité cellulaire pour garantir une plage de mesure linéaire.
- Temps d'Incubation : Ajuster le temps d'incubation avec les agents cytotoxiques en fonction de la sensibilité des cellules et de la nature des agents.
Applications du Test LDH
Le test LDH est polyvalent et peut être utilisé dans diverses applications :
Mesure de la Cytotoxicité Cellulaire
Le test est idéal pour évaluer la cytotoxicité induite par des agents chimiques, des médicaments, ou des toxines. Il permet de déterminer la concentration d'un agent qui provoque la lyse cellulaire.
Évaluation de la Cytotoxicité Cellulaire-Médiée
Le test peut être utilisé pour étudier la cytotoxicité médiée par les cellules immunitaires, comme les lymphocytes cytotoxiques (CTL) ou les cellules NK (Natural Killer).
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Détermination du Nombre Total de Cellules
En mesurant la LDH totale libérée après lyse complète des cellules, il est possible d'estimer le nombre total de cellules dans un échantillon.
Validation des Données Omiques
Les tests LDH peuvent aider à valider les résultats omiques en fournissant une confirmation fonctionnelle des changements dans l'expression des gènes, les niveaux de métabolites ou l'activité des voies. Par exemple, les données de la transcriptomique indiquant une glycolyse altérée peuvent être étayées en mesurant directement la sécrétion ou la consommation de lactate.
Alternatives et Comparaisons
CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay
Ce test est une méthode pratique pour déterminer le nombre de cellules viables. Il utilise une solution de colorant MTT qui est convertie par les cellules vivantes en un produit formazan. La quantité de formazan est proportionnelle au nombre de cellules viables. Il peut détecter aussi peu que 1 000 cellules/puits avec un lecteur de plaques à 96 puits.
Comparaison avec l'Incorporation de Thymidine [3H]
Le test CellTiter 96® peut être substitué à l'incorporation de thymidine radioactive [3H]. L'ajout de la solution de colorant peut remplacer l'impulsion de thymidine radioactive au moment où la thymidine est habituellement ajoutée.
Avantages du Test LDH
- Non-Radioactif : Élimine les problèmes de manipulation et d'élimination des déchets radioactifs.
- Rapide et Facile : Le protocole est simple et ne nécessite pas d'étapes de lavage complexes.
- Sensible : Permet de détecter de faibles niveaux de lyse cellulaire.
- Polyvalent : Adaptable à différents types de cellules et d'agents cytotoxiques.
- Équipement Standard : Utilise un lecteur de plaques standard, disponible dans la plupart des laboratoires.
- Gain de Temps : La configuration du test dans une plaque de culture permet d'éviter l'étape de transfert d'échantillon, courante dans de nombreux tests LDH.
Considérations Importantes
Contrôles
Il est essentiel d'inclure des contrôles positifs (cellules lysées) et négatifs (cellules non traitées) pour valider les résultats.
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Interférences
Certaines substances peuvent interférer avec la réaction enzymatique. Il est important de vérifier l'absence d'interférences avec les agents testés.
Linéarité
S'assurer que la réponse est linéaire dans la plage de concentrations testées.
Compatibilité avec l'Automatisation
La plupart des tests de métabolisme Promega sont optimisés pour les plaques de 96 et 384 puits et peuvent être adaptés aux flux de travail à haut débit. Leur format « ajouter-mélanger-lire » est idéal pour l'automatisation, et les lectures luminescentes sont facilement intégrées aux plateformes HTS standard.
Multiplexage
Plusieurs métabolites peuvent être mesurés en divisant les échantillons dans des puits parallèles. Tous les tests utilisent la même lecture luminescente, de sorte que le multiplexage dans le même puits n'est pas possible. Le multiplexage avec d'autres lectures de santé cellulaire est possible dans de nombreux cas et est démontré dans nos manuels techniques. Il faut éviter les signaux de détection qui se chevauchent (par exemple, luminescence vs fluorescence).
Réactifs et Conservation
Congélation/Décongélation des Réactifs
Certains tests tolèrent plusieurs cycles de congélation/décongélation, tandis que d'autres non. Il est crucial de consulter le manuel technique pour des recommandations spécifiques.
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Types de Microplaques
Utiliser des plaques blanches à parois opaques pour maximiser la réflexion du signal et la sensibilité tout en minimisant la diaphonie entre les puits. Toujours se référer au manuel technique pour des recommandations spécifiques sur les plaques.
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