La reproduction sexuée est un processus fondamental pour le succès évolutif des organismes eucaryotes. Chez les plantes à fleurs, ce processus est caractérisé par un mécanisme unique appelé double fécondation. Cet article explore en détail le schéma de la fécondation chez le lis, en abordant les aspects de la double fécondation, la formation des gamétophytes, le rôle du pollen et les mécanismes d'auto-incompatibilité.
Double fécondation chez les plantes à fleur
La double fécondation est un processus unique qui se produit chez les plantes à fleur (angiospermes). Elle implique la fusion séparée et simultanée de deux cellules spermatiques avec les deux gamètes femelles, à savoir la cellule œuf et la cellule centrale. Cette fusion donne naissance à l'embryon et à l'albumen nourricier, respectivement. L'albumen fournit les nutriments nécessaires au développement de l'embryon.
Une lignée de maïs, appelée « inductrice d’haploïde », présente une double fécondation altérée qui entraîne la production d’embryons haploïdes contenant uniquement les chromosomes maternels. Ce processus est appelé gynogenèse in vivo. Cette lignée inductrice d’haploïde est devenue l'outil privilégié pour de nombreux sélectionneurs de maïs, car elle est centrale dans le processus de production des plantes parfaitement homozygotes en seulement 2 générations au lieu de 5 à 8 dans les schémas de sélection classiques.
Plus de cinquante ans après la découverte de la première lignée inductrice, le gène principal responsable de l'induction a été identifié. Ce gène code pour une phospholipase de type A2, appelée NOT LIKE DAD (NLD), car le génome paternel est absent des embryons haploïdes. Il a été démontré qu'une NLD intacte est nécessaire dans le pollen pour le bon déroulement de la reproduction sexuée.
Un projet de recherche vise à résoudre le mystère selon lequel une protéine membranaire localisée à l'extérieur des cellules spermatiques est nécessaire au maintien de l'intégrité du génome paternel dans les embryons. L'imagerie de la fécondation sera utilisée pour caractériser en détail les différentes étapes et évaluer les défauts lors d'une fécondation avec du pollen inducteur (mutant nld). L’évaluation de l’initiation, de l’étendue et de la spécificité de la fragmentation génomique sera réalisée pour étudier le devenir du génome paternel issu d'un pollen nld. La caractérisation biochimique de l’activité de NLD in vitro, couplée à des analyses de composition lipidique in vivo, fera la lumière sur l’identité des substrats/produits de cette phospholipase et sa fonction biologique. Un premier résultat important de ce projet est la nouvelle localisation sub-cellulaire de la protéine NLD qui localise a l'extérieur des spermatozoïdes. Il a été démontré que la NLD ne localise pas dans le cytosol et la membrane plasmique des spermatozoïdes, mais dans une membrane spécifique qui dérive de la PM de la cellule végétative du pollen et qui entoure les deux spermatozoïdes : l'endo-PM. Il a été démontré qu'un ancrage lipidique et des interactions électrostatiques sont nécessaires au bon adressage de NLD à l'endo-PM. Une étape importante du projet est désormais l'isolement et la caractérisation de nouveaux gènes impliqués dans l'induction haploïde.
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La fleur de lis : structure et organisation
Pour comprendre la reproduction des angiospermes, il est essentiel d'étudier la fleur. Les fleurs de lis sont particulièrement adaptées à cette étude en raison de leur grande taille, qui facilite les coupes et les dissections florales. La fleur de lis est produite vers l’apex des pieds feuillés. Elles sont colorées, et organisées en inflorescence distincte du reste de la plante.
Les pièces florales forment quatre verticilles, c’est-à-dire quatre cercles concentriques de pièces similaires. Elles s’attachent au réceptacle floral, renflement de l’extrémité du pédoncule floral. Chez le lis, les pièces florales des deux premiers verticilles ne sont pas distinguables morphologiquement et sont appelées tépales. Le troisième verticille correspond à l’androcée, formé par les étamines. Le quatrième verticille correspond au pistil, ou gynécée.
La fleur de lis commence au niveau de la bractée, qui est ici grande, plane et photosynthétique. La fleur est située à l’aisselle de la feuille et de la tige, elle est portée par un pédoncule floral. La fleur de lis se compose de :
- deux verticilles de 3 + 3 tépales (qui forment le périanthe), grandes structures foliacées colorées et odorantes.
- un verticille de six étamines, qui forment l’androcée. Chaque étamine est constituée d’un filet surmonté d’une anthère.
- un verticille de trois carpelles soudés par la longueur, qui forment le pistil, ou gynécée (le nombre de lobes du stigmate, ici trois, permet de supposer que le gynécée est formé de trois carpelles).
Une fleur peut être définie morphologiquement comme un ensemble de pièces stériles et fertiles disposées en verticilles sur un axe court, rattaché au reste de la plante par un pédoncule floral. Selon les espèces, une bractée est présente ou non à la base du pédoncule. Les fleurs terminales n’ont jamais de bractée. Une fleur peut aussi être définie, de façon complémentaire, par sa fonction : il s’agit d'un système qui produit les gamétophytes mâles et femelles, et permet leur rapprochement.
Formation des gamétophytes mâles : le rôle du pollen
La partie fertile d’une étamine est l’anthère. L’anthère est formée de deux paires de sacs polliniques à l’intérieur desquels se forment les grains de pollen. À maturité, les sacs polliniques s’ouvrent au niveau de la zone de déhiscence entre chaque paire et libèrent le pollen. En coupe, la symétrie bilatérale de l’anthère évoque la silhouette d’un papillon. Chacune des quatre « ailes » est un sac pollinique, qui protège la sporogenèse et la production des grains de pollen, avant de les libérer. L’assise mécanique présente une paroi lignifiée et agit comme un ressort au moment de l’épanouissement.
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Chez les Angiospermes, deux types de spores sont produites : on parle d’hétérosporie. Ces spores diffèrent par leur taille : les grosses spores sont qualifiées de mégaspores (ou macrospores) et les petites de microspores. Les mégaspores sont produites dans les mégasporanges, sur une mégasporophylle (le carpelle, une feuille modifiée), et donnent par mitoses les mégagamétophytes. Les microspores sont produites par les microsporanges, sur une microsporophylle (l’étamine, une autre feuille modifiée) et donnent par mitoses les microgamétophytes. Par définition, les structures impliquant un plus grand investissement énergétique sont qualifiées de femelles, et les structures impliquant un plus faible investissement énergétique de mâles.
Les grains de pollen sont facilement observables en les prélevant sur les anthères des fleurs épanouies et en les déposant entre lame et lamelle. Il s’agit de structures d’environ 100 µm, ovoïdes et présentant une paroi ornementée. Les gouttelettes jaunes à la surface sont collantes (c’est le pollenkitt). Associées aux reliefs en réseau, elles permettent aux grains de pollen de mieux adhérer aux pollinisateurs. La paroi a un aspect réticulé dû à la présence d’épaississements plus marqués à certains endroits.
L'observation en microscopie optique permet de distinguer la cellule générative, incluse dans la cellule végétative. Le grain de pollen est le gamétophyte mâle. Il est constitué de seulement deux cellules haploïdes contenues dans une paroi complexe et très résistante. Le gamétophyte mâle, tout comme le gamétophyte femelle, est donc très réduit, comme chez toutes les plantes à graines actuelles mais contrairement à ce que l’on peut observer chez les Embryophytes dites « à spores libres » (mousses et fougères). La cellule végétative occupe la majorité du volume. Après la pollinisation, elle permettra la formation du tube pollinique, qui transporte les gamètes. À l’intérieur de la cellule végétative se trouve la cellule générative. Les cellules sont très déshydratées, et contiennent des réserves (lipides, glucides notamment), ce qui est typique de formes de vie ralentie. La partie interne (intine) de la paroi protectrice du grain de pollen est pectocellulosique, et la partie externe (exine) est composée de sporopollénine. Cette dernière est le composé biologique le plus résistant connu, et assure à ce titre une protection mécanique et chimique.
La formation des grains de pollen commence par la prolifération de cellules mères de spores, contenues dans les sacs polliniques. Ces cellules mères des spores s’entourent d’une paroi de callose et subissent une méiose qui produit quatre spores mâles haploïdes, processus qui marque le passage dans la génération gamétophytique du cycle de vie. La paroi de callose est ensuite dégradée et chaque spore se divise par mitose, pour donner la cellule végétative et la cellule générative, cette dernière étant incluse dans le cytoplasme de la cellule végétative. En plus de leur rôle nutritif déjà présenté, les cellules du tapis s’immiscent entre les spores et synthétisent la sporopollénine de l’exine.
Les grains de pollen sont produits dans les sacs polliniques des anthères. Ces sacs polliniques contiennent les cellules mères des spores, diploïdes. Lorsqu’une cellule mère des spores entre en méiose, elle produit quatre spores mâles haploïdes contenues dans une même paroi. Après dégradation de la paroi, chaque spore subit une mitose aboutissant à un grain de pollen bicellulaire, composé d’une cellule végétative à l’intérieur de laquelle est incluse une cellule générative. Notez qu’alors que la plupart des schémas de grain de pollen représentent une seule membrane entourant la cellule générative, cette cellule est en réalité entourée de sa membrane plasmique, de sa paroi et d'une membrane issue de la cellule végétative. Cette cellule générative produit deux gamètes mâles par mitose.
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Formation des gamétophytes femelles : le rôle de l'ovaire et de l'ovule
La partie fertile du pistil est son ovaire. Sa structure à différentes échelles microscopiques peut être observée en réalisant des coupes transversales. L’ovaire forme une sorte d’hexagone lobé et plus ou moins régulier selon les espèces de lis. Il est constitué de trois lames (les carpelles) repliées sur elles-mêmes et soudées l’une à l’autre. Durant leur formation, les ovules sont protégés de la dessiccation et des agressions physiques (notamment par les consommateurs : herbivores, frugivores, parasites…) par l’épiderme et l’épaisse paroi des carpelles. Ces mêmes structures protègent, après la fécondation, les graines issues des ovules.
L’ovaire de lis est formé de trois carpelles soudés. Chaque carpelle contient une loge carpellaire le long de laquelle sont disposés les ovules, par groupes de deux. Les ovules des Angiospermes sont des structures pluricellulaires à l’intérieur desquels est produit le gamète femelle, l’oosphère. L'ovule est constitué de :
- deux téguments protecteurs (caractéristique des Angiospermes, les graines des Gymnospermes n’en possédant qu’un seul).
- le sac embryonnaire, qui correspond au gamétophyte femelle. Il est très réduit, constitué de seulement sept cellules, avec huit noyaux chez le lis, comme chez de nombreuses espèces d’Angiospermes. L’oosphère, le gamète femelle (haploïde), se trouve du côté du micropyle avec deux synergides. Une cellule centrale comporte deux noyaux polaires. Trois antipodes se trouvent à l’opposé du micropyle (côté chalaze).
- Le funicule relie le corps de l’ovule (au niveau de la chalaze) au carpelle (au niveau du placenta).
Les ovules sont situés dans les ovaires. Ils sont reliés à la paroi du carpelle par le funicule. L’ovule est constitué, de l’extérieur vers l’intérieur, de deux téguments protecteurs, du nucelle et du sac embryonnaire qui lui-même contient le gamète femelle.
La formation du sac embryonnaire commence par la méiose de la cellule mère des spores. Quatre noyaux sporiques sont formés dans une cellule, sans cloisonnement membranaire, la cytocinèse se produisant ici après la caryocinèse. Un des noyaux reste indépendant tandis que les trois autres fusionnent en un noyau triploïde. Chacun de ces deux noyaux se divise deux fois par mitose. Les cloisonnements cellulaires (cytocinèse) n’interviennent qu’à la fin des divisions, et de façon irrégulière (7 cellules de dimensions inégales formées pour 8 noyaux). Le noyau haploïde, côté micropyle, est à l’origine de l’oosphère (gamète femelle), des deux synergides et d’un des noyaux polaires. Le sac embryonnaire se forme à partir d’une cellule mère des spores, contenue dans le nucelle. Après méiose, quatre noyaux haploïdes sont produits au sein d’une même cellule (il n’y a pas de cytocinèse après les divisions nucléaires). Trois des noyaux haploïdes fusionnent en un noyau triploïde. Après deux mitoses, toujours sans cytocinèse, huit noyaux sont obtenus. Enfin, l’ensemble se cellularise pour former un sac embryonnaire.
De la pollinisation à la fécondation
Selon la stratégie de reproduction de la plante, le pollen est transporté par le vent (anémogamie), les insectes (entogamie), les oiseaux ou même les chauves-souris frugivores vers d’autres fleurs, où il adhère au stigmate, l’extrémité réceptive souvent visqueuse du ou des carpelles. Certaines espèces, comme Arabidopsis et le tournesol, ont des stigmates secs, et l’adhérence du pollen à la cellule papillaire stigmatique est assurée par des composants de l’exine pollinique.
Après cette étape d’adhérence et de réhydratation, le grain de pollen reprend son métabolisme actif et émet le tube pollinique qui traverse les tissus du pistil pour atteindre l’ovule. Ce qu’on appelle l’unité germinale mâle est formée par un complexe de noyaux végétatifs et de spermatozoïdes. Après la germination du tube pollinique, l’unité germinale mâle est localisée dans la zone apicale du tube à environ 50-100 µm de l’extrémité et maintient la structure du triplet, gardant le noyau végétatif devant les spermatozoïdes.
Les grains de pollen génèrent de nombreux transcrits pour leur germination et la croissance du tube pollinique. Le pollen mature peut conserver de grandes quantités d’ARNm sous la forme de mRNP (ribonucléoparticules avec des ARNm) au repose (0 h). Lorsque les tubes polliniques sont prêts à germer, il y transcription de novo d’ARNm dans un court laps de temps. Dans le tube pollinique en germination, une activité réduite de dégradation de l’ARNm peut contribuer à l’accumulation d’une grande quantité de transcrits (0,5 h). Chez Arabidopsis, le premier bouchon calleux se forme à la partie basale du tube pollinique dans les 3 h suivant la germination. Une traduction locale à l’extrémité du tube pollinique contribue à la croissance active du tube pollinique (4 h). Durant sa croissance, le tube pollinique correspond à la cellule végétale qui s’allonge le plus rapidement et chez Arabidopsis, la une vitesse de croissance peut atteindre 1 cm/h. Toute l’activité de croissance est restreinte au dôme apical du tube pollinique, ce qui fait que le tube pollinique est un modèle très étudié pour la régulation spatiale et temporelle de la croissance polarisée dans les cellules végétales. À mesure que le tube pollinique se développe, son cytoplasme reste dans la zone située derrière l’extrémité apicale et des bouchons de callose se forment à intervalles réguliers pour obturer la partie restante du tube. Ces bouchons de callose sont produits par la callose synthase, dont le positionnement exact dépend des microtubules corticaux.
Les microfilaments d’actine sont essentiels à l’élongation rapide et polarisée des tubes polliniques. Leur perturbation par des inhibiteurs spécifiques entrave la croissance du tube pollinique. La polymérisation de l’actine à l’extrémité du tube pollinique est une étape limitante de la croissance. Des protéines telles que les formines et les facteurs de dépolymérisation de l’actine régulent la nucléation et le renouvellement des microfilaments, établissant la structure d’actine subapicale nécessaire à la croissance efficace du tube.
La croissance du tube pollinique est directionnelle et répond à divers signaux de guidage dans le pistil. Le sac embryonnaire exposé de Torenia fournieri sécrète un facteur attractif qui guide le tube pollinique vers l’appareil filiforme situé entre les deux synergides. Le tube pollinique cible et pénètre la synergide. Les expériences d’ablation confirment que les cellules synergides sont à la fois nécessaires et suffisantes pour l’attraction du tube pollinique vers le gamétophyte femelle. Les synergides sécrètent de petites molécules sous l’induction non cellulaire autonome des cellules centrales pour attirer les tubes polliniques. Chez les mutants, l’absence de sécrétion adéquate de facteurs attractifs conduit les tubes polliniques à ne pas trouver le micropyle, ce qui entraîne un échec de la fécondation.
Auto-incompatibilité : un mécanisme de contrôle
Environ 70 % des Angiospermes ont des fleurs hermaphrodites avec des organes mâles et femelles. On peut donc penser que l’autogamie est majoritaire. En effet, les interactions pollen-pistil créent non seulement une série de barrières d’hybridation interspécifiques mais aussi peuvent restreindre la reproduction entre plantes d’une même espèce mais génétiquement trop proches (on parle alors d’auto-incompatibilité et c’est bien sûr un des freins majeurs à l’autofécondation chez les fleurs qui sont hermaphrodites). La surface des cellules du stigmate, qui sert de site récepteur aux grains de pollen est le point initial de détermination de la compatibilité.
Des recherches chez les Brassicacées ont révélé que le récepteur kinase stigmatique du locus S (SRK) contribue au rejet du pollen intraspécifique et interspécifique via une signalisation dépendante de FERONIA (FER) qui active la production les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Chez Arabidopsis thaliana, STIGMATIC PRIVACY 1 (SPRI1), une protéine stigmatique, est impliquée dans l’établissement de l’incompatibilité interspécifique. Des découvertes récentes ont également montré que les peptides de classe B de la POLLEN COAT PROTEIN (PCP-B) portés par les PG compatibles sont reconnus par le récepteur stigmatique FER d’une manière spécifique à l’espèce, favorisant l’hydratation rapide du pollen conspécifique.
Chez le pavot commun (Papaver rhoeas), le locus d’auto-incompatibilité du pistil code pour des protéines S de faible poids moléculaire qui déclenchent une voie de signalisation dépendant du Ca2+ dans le pollen incompatible. Il en résulte un arrêt rapide de la croissance du tube pollinique, une dépolymérisation de l’actine et l’activation d’une cascade de MAP kinases. L’interaction entre les deux partenaires de l’autoincompatibilité : PrsS (déterminant femelle) et PrpS (déterminant mâle) se fait à la surface du tube pollinique; la protéine pollinique SBP faciliterait cette interaction. Le complexe PrsS-PrpS contrôlerait l’activité de canaux calciques produisant l’entrée massive de calcium. Le calcium agit comme un messager secondaire provoquant : (i) la dépolymérisation rapide de l’actine, (ii) la phosphorylation de protéines cibles : P26, une protéine cytoplasmique présentant des homologies avec une pyrophosphatase et P56, une MAP kinase putative et (iii) l’activation de marqueurs d’apoptose comme des caspases.
Développement de la graine et du fruit
La graine est issue de la transformation de l’ovule suite à la double fécondation. L’embryon provient de la fécondation de l’oosphère et l’albumen de celle de la cellule centrale. Après fécondation, les ovules se transforment en graines et l’ovaire se transforme en fruit. On retrouve globalement les structures observées dans l’ovaire de la fleur, dont le volume a considérablement augmenté. Les carpelles forment une enveloppe dans laquelle se développent six rangées de graines.
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