Introduction
L'ovocyte de Xénope est un modèle d'étude très adapté pour la division cellulaire, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Les ovocytes de vertébrés et de mammifères passent la majorité de leur vie dans un état de dormance, résidant dans les follicules primordiaux. Cet arrêt, très analogue au stade G2 de la division mitotique du cycle cellulaire, n'est interrompu que quelques heures avant l'ovulation, lorsqu'une montée hormonale induit la synthèse protéique et l'entrée dans la première division méiotique. L'étude des mécanismes moléculaires qui régissent l'arrêt et la reprise de la méiose ovocytaire est cruciale pour comprendre la fertilité, le développement embryonnaire et certaines pathologies comme le cancer.
Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d’étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d’ovocytes, ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l’ovocyte humain que ne l’est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme.
Le Cycle Cellulaire et la Méiose
Les cellules se multiplient par des divisions répétées qui assurent la croissance et la reproduction de tous les êtres vivants. Le cycle cellulaire est un processus fondamental qui assure la croissance et le développement des êtres vivants. Dans un cycle, les quatre phases se succèdent dans un ordre immuable : G1, S, G2 et M. Les trois premières phases (G1, S, G2) constituent l’interphase, durant laquelle le noyau de la cellule est limité par une enveloppe nucléaire, alors que la mitose (M) est caractérisée par la disparition de cette enveloppe et par l’apparition des chromosomes. Ces derniers deviennent alors visibles au microscope photonique parce qu’ils se compactent. Pour assurer, d’une part, l’ordre immuable de la succession des quatre phases du cycle (régulation du cycle), et d’autre part, l’obtention de deux cellules filles rigoureusement identiques (surveillance de l’ADN), la cellule dispose de systèmes de régulation hautement perfectionnés.
Lors de l’ovogenèse, les ovocytes entament la méiose et s’arrêtent en prophase de 1ère division méiotique (équivalent à une phase G2). Des signaux extracellulaires provoquent la reprise de la méiose en lançant des voies de transduction qui convergent vers l’activation du MPF. Les ovocytes de vertébrés et de mammifères passent la majorité de leur vie dans un état de dormance, résidant dans les follicules primordiaux. Cet arrêt, très analogue au stade G2 de la division mitotique du cycle cellulaire, n'est interrompu que quelques heures avant l'ovulation, lorsqu'une montée hormonale induit la synthèse protéique et l'entrée dans la première division méiotique.
Le MPF (Maturation Promoting Factor)
C’est l’activation du MPF (M-phase Promoting Factor, ou complexe Cdk1-cycline B) qui déclenche la division cellulaire. La connaissance des mécanismes de contrôle du cycle cellulaire est essentielle et a fasciné les biologistes depuis longtemps. Curieusement, malgré l’intérêt majeur suscité par ce processus, un manque criant de connaissances règne sur certaines étapes cruciales du cycle, en particulier le contrôle de la transition G2-M. Le projet OOCAMP a pour objectif d’améliorer nos connaissances de la transition G2-M par une approche physiologique basée sur l’utilisation des ovocytes d’un amphibien, le xénope, et d’un cnidaire, la méduse Clytia : deux modèles expérimentaux simples et puissants, caractérisés par des arrêts naturels dans le cycle cellulaire, débloqués par des stimuli externes définis capables d’induire la reprise du cycle cellulaire.
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L'injection du cytoplasme prélevé dans un ovocyte II maturé (bloqué en métaphase II) dans un ovocyte I, induit l'entrée en méiose de ce dernier. Cette expérience montre qu’une substance contenue dans le cytoplasme de l’ovocyte bloqué en métaphase II peut induire la maturation. Ce facteur a été appelé MPF (Maturation Promoting Factor). On s’aperçut par la suite que le MPF n’est pas seulement le déclencheur de la méiose ovocytaire, mais qu’il déclenche aussi l’entrée en mitose (phase M) des cellules somatiques. En réalité le cytoplasme injecté contient du MPF « actif » (c’est justement parce que ce MPF est maintenu actif que l’ovocyte est bloqué en métaphase II).
Mis en évidence en 1971, le MPF ne sera identifié et caractérisé précisément qu’en 1988. Ce complexe cycline / Cdk agit en déclenchant différentes réactions.
Rôle de l'AMPc et de PKA
L’AMPc est le 1er effecteur impliqué en amont de ces voies, mais de manière surprenante il agit de manière opposée selon les espèces. Chez les vertébrés, la concentration en AMPc, et donc l’activité de la kinase PKA, sont maintenus à de hauts niveaux dans l’ovocyte bloqué en prophase, et doivent chuter pour permettre la reprise de la division méiotique (une situation analogue à celle du contrôle exercé par l’AMPc sur la transition G2-M du cycle mitotique). Au contraire, chez de nombreux invertébrés, comme Clytia, une augmentation d’AMPc et de l’activité PKA est requise pour permettre la sortie de l’arrêt en prophase. Nous avons pour objectif de comprendre la régulation exercée par l’AMPc en comparant et en interchangeant les régulateurs et les effecteurs du système AMPc dans deux modèles expérimentaux, le xénope et Clytia, chez lesquels l’AMPc joue un rôle opposé.
Dans l'ovocyte de xénope, une diminution de l'activité de la kinase PKA est nécessaire pour la reprise de la méiose. Dupré et ses collaborateurs ont montré que la phosphorylation d'ARPP19 par la protéine kinase A (PKA) empêche la reprise de la méiose dans les ovocytes de Xénope.
ARPP19 : Un Régulateur Clé
Nous nous focaliserons sur une protéine appelée ARPP19, dont nos données préliminaires chez le xénope indiquent qu’elle correspond au substrat critique de PKA responsable de l’arrêt en prophase des ovocytes de vertébrés. Une phosphorylation distincte d’ARPP19, catalysée par la kinase Greatwall (Gwl) transforme ARPP19 en un activateur du MPF, essentiel à l’entrée en division. Nous avons identifié l’homologue d’ARPP19 chez Clytia, qui possède les sites de phosphorylation par PKA et Gwl. Nous comparerons les fonctions des deux versions d’ARPP19.
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Dupré et Jessus ont mis en évidence que la kinase Greatwall est dominante sur PKA dans le contrôle de la fonction antagoniste d'ARPP19 dans les ovocytes de Xenopus. De plus, la phosphorylation d'ARPP19 par Greatwall rend l'auto-amplification du MPF indépendamment de PKA dans les ovocytes de Xenopus.
Lemonnier et al. ont démontré que la phosphatase régulatrice de la phase M, PP2A-B55δ, s'oppose à la protéine kinase A sur Arpp19 pour initier la division méiotique.
Kinases et Phosphatases : Un Équilibre Délicat
Pour assurer, d’une part, l’ordre immuable de la succession des quatre phases du cycle (régulation du cycle), et d’autre part, l’obtention de deux cellules filles rigoureusement identiques (surveillance de l’ADN), la cellule dispose de systèmes de régulation hautement perfectionnés. Dans le premier cas, (régulation du cycle), ce sont essentiellement des kinases cycline-dépendantes, les Cdk, qui interviennent. Les différentes phases du cycle ont lieu selon l’ordre immuable cité plus haut et c’est pour assurer le maintien de cette séquence qu’interviennent des Cdk assurant la régulation du cycle cellulaire.
L'entrée en mitose, ou transition G2 / M, est sous le contrôle du complexe Cycline B / Cdk1, et se réalise de manière brutale. La Cycline B s'accumule progressivement pendant les phases S et G2, ce qui conduit à une accumulation graduelle du complexe au fur et à mesure que la cellule approche de la mitose. La Cdk1 est alors phosphorylée sur la thréonine 161 par la CAK (Cycline H / Cdk7), mais reste inactive à cause de la phosphorylation de 2 acides aminés voisins (tyrosine 15 et thréonine 14) par la protéine Wee-1. Ainsi, quand la cellule atteint la fin de la phase G2, elle contient un abondant stock de Cycline B / Cdk1 ( stock de pré-MPF inactif) prêt à agir mais dont l’activité est réprimée par la présence de 2 groupes phosphate qui bloquent la kinase.
Lorsque la réplication est terminée, la phosphatase Cdc25 n'est plus séquestrée dans le cytoplasme et passe dans le noyau, et en fin de phase G2, la phosphatase Cdc 25 est activée, probablement par phosphorylation par la kinase Polo. Cdc 25 a alors pour action d'enlever les deux phosphates inhibiteurs de Cycline B / Cdk 1. Cdk 1 peut alors phosphoryler Cdc 25 (sur un site différent de celui de la kinase Polo). Cette phosphorylation active Cdc 25 : Cycline B / Cdk 1 active donc son propre activateur (processus d'auto-activation). Selon ce mécanisme, une activation partielle de Cdc 25 par la kinase Polo permet l’activation d’une sous population de complexes Cycline B / Cdk 1 qui, par la suite, phosphoryle plus de Cdc-25 et de Wee-1. Les complexes Cycline B / Cdk 1, une fois activés, permettent l'entrée en mitose.
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Points de Contrôle et Surveillance de l'ADN
En plus des Cdk, molécules permettant le passage d’une phase à l’autre et l’enchaînement des événements du cycle, existent des mécanismes capables de surveiller des processus très importants du cycle, de détecter des anomalies et d’imposer l’arrêt du cycle si des anomalies sont constatées. Ces mécanismes interviennent lorsque des lésions (DDCP = DNA Damage Checkpoint) ou des anomalies de réplication de l’ADN (RCP = Réplication Checkpoint) sont détectées, ou pour contrôler que les chromatides-sœurs vont bien se répartir équitablement dans les deux cellules filles (MCP = Mitotic Checkpoint). En effet, cette surveillance assure le maintien de l’intégrité de l’ADN et la qualité de la réplication de l’ADN. Si l’ADN présente des lésions ou si la réplication ne s’effectue pas correctement, le cycle est arrêté pour donner à la cellule le temps de réparer et de terminer correctement la réplication.
La surveillance de l’intégrité de l’ADN (DDPC) n’est pas réalisée en un point particulier du cycle mais s’effectue en réalité tout au long de l’interphase (G1, S, G2). Ainsi, lorsqu’une lésion de l’ADN existe, le cycle peut être arrêté soit en G1, (la cellule n’effectue alors pas la transition G1/S), soit en S, soit en G2 (la cellule ne rentre alors pas en mitose). La surveillance de l’accomplissement de la réplication (RCP) ne se fait pas en un point précis du cycle mais s’étale tout au long de la phase S et de la phase G2. Ainsi, la cellule ne pourra pas commencer la mitose tant que la réplication n’est pas correctement terminée et lorsqu’un défaut de réplication est détecté, la cellule arrête le cycle. La surveillance de l’attachement correct des chromosomes métaphasiques au fuseau, ou checkpoint mitotique (MCP), ne s’exerce que dans le court laps de temps de la métaphase et jusqu’à ce que le dernier chromosome ait atteint la plaque métaphasique.
Implications en Santé
Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l’homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l’origine d’interruptions de grossesses ou d’anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l’espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse.
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