L'étude du développement embryonnaire est un domaine fascinant qui révèle comment une simple cellule fécondée peut donner naissance à un organisme complexe. Parmi les modèles animaux utilisés pour percer les mystères de ce processus, les amphibiens, et plus particulièrement le genre Xenopus, occupent une place de choix. La transparence de leurs œufs et la facilité avec laquelle leur développement peut être observé et manipulé en font des outils précieux pour les chercheurs. Cet article explore les étapes clés du développement embryonnaire chez les amphibiens, en mettant l'accent sur les processus de fécondation, de segmentation, de gastrulation et de neurulation, et en soulignant l'importance du Xenopus dans ce domaine de recherche.
Xenopus laevis : Un modèle d'étude privilégié
Comment, à partir d'un oeuf, s'édifie un nouvel individu ? C'est ce que va dévoiler l'observation des grenouilles Xenopus laevis qui se reproduisent dans les étangs africains. Cet amphibien a été très étudié et sert de modèle pour l'étude du développement embryonnaire. La transparence de la gangue qui entoure les oeufs permet en effet une observation directe des phénomènes. Leur développement est rapide et sa progression peut être modulée par la température selon les besoins de l’expérimentateur (en évitant des changements trop violents cependant, notamment lors de la gastrulation car cela peut amener à des malformations).
Deux espèces de Xenopus sont particulièrement utilisées dans la recherche : X. laevis et X. tropicalis. Xenopus laevis produit de gros embryons qui sont excellents pour la microchirurgie embryonnaire, l’analyse de la surexpression des gènes, les études biochimiques. De son côté, Xenopus tropicalis est un organisme diploïde qui facilite les études de perte de fonction. Les ovocytes et les embryons de Xenopus tropicalis sont cependant plus petits que ceux de Xenopus laevis. Le génome des xénopes a une conservation importante avec l’Homme. Celui de Xenopus tropicalis contient des orthologues pour environ 79 % des gènes identifiés dans les maladies humaines.
La fécondation : Le point de départ
Au sortir de la femelle, les œufs non encore fécondés présentent des régions pigmentées et blanches correspondant respectivement à l’hémisphère animal et à l’hémisphère végétatif. La disposition aléatoire des œufs les montre sous leurs différents aspects. Une demi-heure après la fécondation, l’œuf de xénope s’oriente en fonction de la pesanteur. L’hémisphère végétatif, plus dense, s’oriente vers le bas, laissant apparaître à l’observateur l’hémisphère animal pigmenté. Au centre de la tache de maturation, un point pigmenté marque l’emplacement où sont expulsés les globules polaires.
La fécondation chez les amphibiens peut être externe (anoures) ou interne (urodèles). La fécondation doit avoir lieu dès l’émission des ovocytes par la femelle chez les anoures. Chez les urodèles, la fécondation a lieu au niveau du cloaque de la femelle ; il n’y a pas d’organe copulateur. Le mâle émet un spermatophore (formation mucilagineuse) au niveau duquel sont agglutinés les spermatozoïdes. Il y a monospermie chez les anoures (un seul spermatozoïde rentre) mais polyspermie chez les urodèles (5 ou 6 spermatozoïdes rentrent mais un seul va féconder le noyau). Le spermatozoïde perd son flagelle.
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L’acrosome vient se fixer sur un récepteur, traverse la membrane vitelline et, au contact de la membrane plasmique, va produire une dépolarisation de la membrane en modifiant le potentiel de celle-ci. Cette dépolarisation de quelques minutes est suivie d’une repolarisation. Ce phénomène entraîne une libération de Ca2+ (Ca qui provient du réticulum endoplasmique lisse et des mitochondries) dans la région corticale de l’œuf. Ce Ca permet la polymérisation des filaments d’actine (allongement de la cellule), ce qui a pour effet d’amener à la surface des granules corticaux. Ces granules libèrent leur contenu en faisant fusionner leur membrane (exocytose). Le gel formé dans l’espace périvitellin permet la rotation de l’œuf dans la demi-heure : c’est le premier phénomène d’activation externe. On trouve la rotation d’équilibre. Cette rotation est appelée rotation de symétrisation et montre que l’embryon a délimité ses régions. Lorsque la fécondation est monospermique, le croissant gris apparaît toujours diamétralement opposé au point de pénétration du spermatozoïde. La future face dorsale n’est pas une région très déterminée. Le décollement de la membrane empêche la polyspermie.
Le déplacement des molécules suppose l’initiation d’un mouvement et l’utilisation d’un support. Au cours de la rotation de symétrisation, on constate la formation d’un réseau de microtubules orientées parallèlement à la surface de l’œuf et servant de support au déplacement des déterminants moléculaires. Tout ceci plaide en faveur d’une localisation moléculaire différentielle déterminant la future face dorsale de l’embryon. Du cytoplasme de la région du croissant gris qui est injecté sur la face ventrale d’un autre embryon va induire un deuxième embryon (siamois).
La segmentation : Division et multiplication cellulaire
Environ 2h30 après la fécondation, le premier plan de clivage de la première mitose apparaît. Il partage la cellule-œuf en deux premières cellules de taille identique. Le second plan de clivage apparaît 20 à 25 minutes après le premier plan de clivage et perpendiculairement à celui-ci. Par la suite, les plans de clivage se succèdent et découpent le volume de l’œuf fécondé en plusieurs centaines de cellules. C’est une phase de divisions cellulaires : on passe d’un œuf unicellulaire à une blastula (6 à 10000 cellules). Le premier plan de division passe par l’axe pôle animal/pôle végétatif, dit méridien et donne 2 blastomères égaux. Les cycles cellulaires se poursuivent rapidement, sont synchrones jusqu’à la 10ème ou 12ème division puis, deviennent asynchrones.
Il y a une expression maternelle des gènes : toutes les protéines synthétisées le sont à partir d’ARN maternel stocké. On a l’apparition d’un asynchronisme des divisions cellulaires. Au départ, on a un stade morula. Il y a apparition d’une cavité de segmentation. Cette blastula va synthétiser des molécules. A la fin de la segmentation, les micromères (du pôle animal) vont former la matrice extracellulaire qui permettra la suite des événements.
La gastrulation : Mise en place des feuillets embryonnaires
La gastrulation (4 premiers schémas) est une étape du développement embryonnaire au cours de laquelle les principaux organes se mettent en place. Sur les schémas proposés, l'embryon de la grenouille (amphibien) est figuré en coupe sagittale. Cette étape importante se caractérise par l'invagination d'une partie des cellules situées en surface de l'embryon, par un orifice apparu précocement à ce stade : le blastopore. Les tissus invaginés, sortes de feuillets cellulaires, engendrent une poche intérieure, qui deviendra l'intestin primitif (ou archenteron).
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Ces trois feuillets vont migrer et s’emboîter pour former l’ectoderme, le mésoderme et l’endoderme. Il y a apparition d’une encoche blastoporale sous l’emplacement du croissant gris. Cette invagination intéresse un peu d’endoblaste, la plaque précordale (pharynx) puis le cordomésoblaste ainsi que le mésoblaste somitique et latéral. Quand la gastrulation est terminée, les lames mésodermiques droite et gauche ne se sont pas encore rejointes. D’un germe à deux ensembles cellulaires (pôle animal et pôle végétatif), on passe progressivement, au cours de la gastrulation, à trois ensembles cellulaires qui s’emboîtent les uns dans les autres pour donner trois feuillets fondamentaux.
La neurulation : Formation du système nerveux
Le processus d’induction neurale se fait lors de la gastrulation. Le cordomésoblaste vient au contact de l’ectoderme et induit celui-ci en plaque neurale (neurectoderme). Au début de la neurulation, il y a mise en place de la plaque neurale. Ces traînées pigmentaires sont dues à un épaississement du neurectoderme en plaques neurales. Des bourrelets neuraux vont s’épaissir, se soulever puis se souder pour former le tube neural. La fermeture se fait d’abord dans la région du tronc puis dans celle de la queue (région caudale) et enfin, dans la région antérieure. Ce tube nerveux donnera l’encéphale et la moelle épinière.
Pendant que se déroule la neurulation, on assiste à une régionalisation du mésoblaste en lame cellulaire pleine formant la voûte et les parois latérales de l’archantéron. Alors que les lames latérales se rejoignent ventralement, le mésoderme dorsal s’individualise, la corde s’isole et le mésoderme dorsal se métamérise en somites (blocs métamérisés). La région dorsale externe va donner le dermatome (derme de la peau). La région supérieure interne va donner le myotome (muscle strié), la partie inférieure interne donnera le sclérotome (les vertèbres). L’endoblaste donnera l’épithélium du tube digestif, de l’appareil urinaire et pulmonaire. Celui-ci est étroite association avec le mésoderme splanchnique.
Au cours de la neurulation, le germe s’allonge dans le sens antéropostérieur. A la fin de cette neurulation, on distingue la tête et la queue : c’est le stade du bourgeon caudal. On assiste à une régionalisation du système nerveux donnant l’encéphale et la moelle épinière. Cet encéphale va devenir inducteur vis à vis de l’ectoblaste. Le rhombencéphale induit la placode auditive ou otique.
L'organogenèse et le rôle du Xenopus dans sa compréhension
Comme chez tous les vertébrés, l’organogenèse est un phénomène discontinue. Après une phase de multiplication, les ovogonies deviennent des ovocytes primaires restant bloqués en prophase méiotique. Viennent ensuite les ovocytes secondaires qui, une fois libérés de l’ovule, sont captés par l’oviducte. Il y a lors fécondation. En trois ans, l’ovocyte primaire augmente de taille : elle passe de cinquante micromètres à 2 millimètres. Ces ovocytes permettent le stockage de matériaux dans les ovaires. endogènes (ARN messagers, transcrits), ils permettent une multiplication nucléaire. Dans l’ovaire, l’ovocyte primaire augmente considérablement de taille durant trois ans chez Rana esculenta, avant la ponte ovulaire. Dans l’ovocyte primaire, il y a stockage de matériaux nutritionnels d’origine exogène apportés par la circulation maternelle. Il y a des protéines, des vitellogénines qui sont synthétisées par le foie de la mère et captées par les cellules folliculaires entourant l’ovocyte puis, transformées par l’ovocyte après déshydratation en complexes phosphoglycolipoprotéiques. L’ovocyte primaire stocke aussi du matériel d’origine endogène permettant l’expression de l’information génétique. A maturité, cet ovocyte primaire a un noyau volumineux excentré vers le côté.
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L’ovocyte va stocker des matériaux exogènes. Le précurseur est la vitellogénine (470 kDa). Celle-ci est synthétisée par le foie de la femelle, elle circule dans le sang et va être internalisée dans des endosomes puis dans des lysosomes et, elle sera enfin dégradée en phosphovitine et lipovitelline qui vont être déshydratées et qui vont donner les plaquettes vitellines (structure cristalline). Elles sont stockées en réserve puis dégradées par des enzymes le moment venu. Au pôle végétatif : les grosses plaquettes vitellines vont rester sur place. Les matériaux endogènes : ont trouve du glycogène stocké autour des noyaux, des ribosomes, du réticulum endoplasmique et des lipides (tous sont répartis autour du noyau). On trouve de l’ARN de tous types qui est réparti d’une certaine manière. L’ARN messager Vg va coder pour la synthèse de facteurs de développement du pôle ventral dans l’induction du mésoderme. Cet ovocyte se libère de l’ovaire et sera émis dans l’oviducte femelle. Il y a alors reprise de la première division méiotique, métaphase I, avec production d’un globule polaire qui donnera un ovocyte II qui restera en métaphase II dans l’oviducte. Cet ovocyte s’entoure d’une gangue glycoprotéique (muqueuse) qui est sécrétée durant le transport dans l’oviducte. Elle a pour fonction de créer des conditions favorables pour la fécondation. Elle apporte des ions comme Ca2+ et Mg2+. Elle a aussi un rôle protecteur en empêchant les œufs de se déshydrater quand ils sont émis hors du cloaque. Celle-ci est variable chez les amphibiens.
Les embryons de xénope et notamment de Xenopus laevis qui sont plus gros se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire. Fait important, parce que les premiers stades de clivage sont holoblastiques (par opposition aux clivages méroblastiques chez les embryons de poule ou de poisson zèbre), le vitellus (réserves énergétiques) est distribué à toutes les cellules, de sorte que les explants ne nécessitent aucune nutrition supplémentaire car ils peuvent survivre en utilisant les nutriments stockés dans les cellules. Le tissu disséqué se développe et se différencie dans une simple solution saline. Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas. Sans intervention, ces cellules finissent par se développer en petits organoïdes épidermiques.
L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
Techniques d'étude du développement chez Xenopus
Plusieurs techniques permettent d'étudier le développement embryonnaire chez Xenopus.
Microinjection et morpholinos
Les ovocytes et les embryons de Xenopus sont relativement grands, ce qui facilite la microinjection de substances telles que l'ARNm et les oligonucléotides morpholino (MO). Les MO sont utilisés pour bloquer l'expression de gènes spécifiques, permettant ainsi d'étudier leur rôle dans le développement.
Un morpholino (MO) antisens inhibant l’expression de Pax3 est injecté dans un blastomère d’un embryon de xénope au stade 2 cellules. On injecte également l’ARNm qui code la β-galactosidase. On laisse se développer l’embryon jusqu’au stade désiré (ici neurula), on le fixe, on révèle l’activité de la β-galactosidase avec du RedGal (points rouges) pour savoir de quel côté de l’embryon se trouvent les cellules issues du blastomère injecté puis on le traite en hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l’ARNm du gène Ak3 (marquage bleu). On constate que l’expression du gène Ak3 est diminuée du côté injecté par le MO anti-Pax3, montrant que (directement ou indirectement) Pax3 est nécessaire à la bonne expression de ce gène.
Création d'animaux transgéniques
Un autre avantage majeur de l’utilisation de Xenopus pour étudier le développement est la capacité de générer des animaux transgéniques. L’incorporation d’ADN exogène dans le génome d’un zygote a été développée chez Xenopus tropicalis et Xenopus laevis à la fin des années 1990. Lorsqu’il correspond à un rapporteur fluorescent comme la GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique, l’expression d’un transgène peut être surveillée au fil du temps dans un embryon vivant en développement. Des lignées rapportrices, par exemple de l’activité d’une voie de signalisation, peuvent être étudiées.
CRISPR/Cas9
La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Représentation schématique de la mutagenèse ciblée du gène de la tyrosinase (tyr), comme exemple de processus pour créer des mutants. Les mutants homozygotes au locus tyr présentent un albinisme oculocutané. L’ARNm ou la protéine Cas9 est co-injecté avec un ARNsg spécifique de tyr dans des zygotes (en haut à gauche). Les embryons F0 sont des mosaïques : ils sont constitués de populations de cellules contenant différents allèles mutants et de tissus de type sauvage (Les quantités relatives de cellules mutants par rapport aux cellules normales sont probablement fonction à la fois du moment de la mutagenèse et de l’efficacité des sgRNA individuels pour diriger Cas9 vers les sites cibles). Dans le cas du ciblage de tyr, la perte biallélique de fonction du gène entraîne un déficit de synthèse de mélanine, qui se manifeste par une perte de pigmentation des yeux et de la peau. Les animaux mosaïques F0 peuvent être croisés pour produire des mutants non mosaïques (hétérozygotes ou homozygotes composés) (tyr−/−), ainsi que des porteurs (tyr+/−) et une progéniture F1 de type sauvage. Tout dépendra si les cellules mutées ont participé à former les gamètes de F0.
Analyse comparative
En plus des méthodes perte- et gain-de-fonction efficaces et peu coûteuses, Xenopus présente des avantages pour l’analyse comparative des structures. En effet, l’injection d’une seule cellule de l’embryon à deux cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l’embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l’embryon et le comparer au côté non injecté. De telles manipulations sont très utiles car elles fournissent un contrôle interne chez le même animal pour chaque expérience. En plus de l’injection au stade 2 cellules, les embryons de xénope ont une carte du destin cellulaire bien définie pour chaque système organique. Cela permet des injections ciblées, où l’expression des gènes peut être modifiée dans des organes ou des tissus spécifiques.
Exemples d'études utilisant Xenopus
Le xénope n’a pas été que utile pour étudier le développement embryonnaire stricto sensu mais a aussi permis des avancées dans des domaines de génétique et de biologie cellulaire plus fondamentaux.
Analyse du transcriptome d'explants de calotte animale
Exemple d’étude pour lequel le xénope est un excellent modèle : Analyse du transcriptome d’explants de calotte animale de stade 12. (A) Des ARNm de gènes d’intérêt (Cerberus, Wnt8, Chordine, FGF8, Xnr2, BMP4) sont injectés dans toutes les cellules d’un embryon au stade 4 cellules. La calotte animale est ensuite prélevée au stade 9 (blastula âgée) et cultivée jusqu’à l’équivalent du stade 12 (gastrula). Les cellules de la calotte animale sont cultivées non dissociées (les cellules donnent alors de l’épiderme) ou dissociées (elles donnent du tissu neural). Les ARNm des cellules ont été purifiés puis soumis au RNAseq (B) « Heatmap » montrant les changements de l’expression des gènes dans chacune des situations par rapport au cas des cellules provenant d’embryons non injectés et aussi avec des demi-embryons V/D dérivés de la même couvée d’embryons. V/D, ventral/dorsal. Une matrice de corrélation de la dissociation de la calotte animale (induction neurale) (C) et des signatures de l’épiderme (D) dans les données d’ARN-seq est présentée. Les scores de corrélation ont été calculés sous forme de coefficients de corrélation de Pearson et codés par couleur comme indiqué dans la barre d’échelle à droite du panneau. Ces résultats montrent que les signatures de calottes animales obtenues via RNA-seq distinguent facilement les conditions d’induction neuronale et épidermique. (E) Signature de dissociation examinée via PCA pour analyser la dimensionnalité dans neuf conditions expérimentales (BMP/con AC, Ven/Dor, FGF8/con AC, Xnr2/con AC, Wnt8/con AC, Cer/con AC, Diss/con, Dor /Ven et Chrd/con AC). AC, calotte animale ; con, contrôle; Dor, dorsale ; Ven, ventral. Chaque axe représente une composante principale (PC1 et PC2), le premier présentant la plus grande variation. Conditions de formation de l’épiderme en cluster PCA (Ven et BMP), conditions d’induction neuronale (Diss, Cer, Chrd et D/V) et conditions de formation du mésoderme (FGF8 et Xnr2) sans biais systémique. Notez que les conditions épidermiques et de dissociation (qui génère du tissus nerveux) se situent sur des quadrants opposés, indiquant les plus grandes différences. (F) Tableau des gènes induits par l’ARNm de Cer, la dissociation, l’ARNm de Chrd et l’ARNm de Wnt dans les coiffes animales répertoriés selon l’induction de Cerberus. Parce que Bighead a été induit dans toutes les conditions de neuralisation et classé deuxième dans la liste, il a été choisi pour une analyse plus approfondie. On voit bien la puissance du xénope pour les criblages très précis.
Mise en évidence de CSF
Mise en évidence de CSF chez le xénope. La maturation de l’ovocyte entraîne une augmentation de l’activité du MPF (Maturation Promoting Factor qui est la cycline B - CDK1), qui culmine lors de l’ovulation, maintenant l’ovocyte en arrêt de cycle en métaphase II grâce au CSF (Cytostatic Factor). Cet arrêt est levé après la fécondation, entraînant une chute de l’activité MPF et le début des divisions cellulaires du zygote (stades 2, 4 puis 8 cellules).Si on réalise un transfert cytoplasmique d’un ovocyte mature non fécondé vers l’une des cellules d’un embryon à 2 cellules, cette cellule ne se divise plus (elle est dit « en arrêt CSF ») démontrant la capacité du cytoplasme de l’ovocyte mature à maintenir l’activité MPF et à bloquer le cycle.
Test de grossesse
Utilisation historique de Xenopus laevis comme test de grossesse (test de Hogben). De l’urine en provenance de la femme dont on veut savoir si elle enceinte est injecté dans une femelle Xénope. Si au bout de 48 heures, une ponte s’est déclenchée, cela veut dire que l’urine de la femme contenait de l’hCG (ou hormone chorionique gonadotropique) produite par le placenta et qui a provoqué la ponte des xénopes.
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