L'étude du développement embryonnaire a longtemps été entravée par la complexité et l'opacité des tissus biologiques. Rendre les embryons transparents a révolutionné ce domaine, ouvrant des perspectives inédites pour l'observation et la compréhension des mécanismes fondamentaux de la vie. Cet article explore les avancées récentes en matière de transparisation des embryons et leurs implications pour la recherche en biologie du développement, en mettant en lumière l'impact de ces techniques sur notre compréhension de l'embryogenèse humaine.
Caenorhabditis elegans : Un modèle transparent pour la biologie du développement
Caenorhabditis elegans, un ver nématode transparent d’environ 1 mm de longueur, est un animal modèle de laboratoire ayant permis de nombreuses découvertes fondamentales en biologie. Dans la plupart des populations sauvages, les adultes pondent leurs embryons lorsque la nourriture est abondante. En revanche, en absence de nourriture, les embryons éclosent et se développent à l’intérieur de la mère, entraînant sa mort. Ce phénotype, anciennement plastique, est désormais génétiquement fixé chez plusieurs souches sauvages de C. elegans, comme celle représentée ici. À l’intérieur de l’adulte transparent, on distingue clairement des embryons en développement (en forme de pilules) ainsi que de jeunes larves récemment écloses, de même morphologie que l’adulte. C. elegans possède un cycle de vie rapide : les embryons éclosent en environ une journée, les larves traversent quatre stades juvéniles, puis le ver atteint l’âge adulte reproducteur en trois à quatre jours. Grâce à ces caractéristiques, C. elegans est devenu essentiel en génétique, génomique, biologie du développement, biologie évolutive et neurobiologie. Il est probablement l’organisme multicellulaire le mieux compris à ce jour.
Les défis traditionnels de l'étude du développement embryonnaire
Jusqu'à récemment, nos connaissances sur le développement de la tête étaient limitées par des considérations techniques. La tête est un ensemble particulièrement complexe, composé d’un grand nombre de tissus différents. Son développement pose question. Jusqu'à présent, nos connaissances reposaient sur des techniques assez anciennes. Alain Chédotal, directeur de recherche Inserm, professeur des universités et praticien hospitalier à l'Université Claude Bernard Lyon 1, explique : "Pour voir un tissu, on est obligé de le couper en tranches fines, en coupes fines, de quelques microns d'épaisseur, et on utilisait des colorations qu'on appelle histologiques, qui marquent toutes les cellules de la même façon, avec les couleurs roses ou violettes un petit peu. Et donc après, ça a pris des générations d'anatomistes pour essayer de deviner un petit peu ce qu'on voyait, et essayé de reconstituer un peu les structures, et puis à partir de ces coupes, de suivre une image, des fois, on utilisait des modèles en cire, des différentes stratégies, pour essayer de comprendre comment un organe pouvait se développer." Globalement, si on apprend même actuellement l'embryologie en tant qu'étudiant en médecine, on va utiliser les travaux qui ont été générés, notamment pour la tête, dans les années 50 à peu près, ou jusqu'aux années 50. On se satisfaisait de ça, il n'y avait pas vraiment non plus de technique autre qui existait permettant d'appréhender la question, c'est-à-dire comment on peut imager une structure tridimensionnelle, comme un embryon, comme une tête, avec des techniques modernes. Et ça a été possible dans les dernières années grâce à des développements technologiques qui sont apparus.
Le problème est qu'en coupant les échantillons en petits bouts, on les plisse, on les malmène donc on abîme les tissus. Il n’est pas facile de visualiser mentalement l'intégralité d’un organe avec des tranches de quelques centaines de micromètres seulement.
La transparisation : Une révolution dans l'imagerie embryonnaire
Pour s'en affranchir, il a fallu remettre au goût du jour une ancienne technique il y a une dizaine d'années, c'est la transparisation, une méthode pour rendre n’importe quel tissu ou organe transparent. Prenez un organe à disséquer. Et au lieu de faire des coupes, traitez le chimiquement pour enlever certaines molécules qui bloquent la lumière, notamment les lipides des membranes cellulaires et l’eau. Utilisez ensuite des anticorps bardés de molécules fluorescentes qui vont se fixer sur les cellules que vous souhaitez marquer. Passez le tout sous un microscope à feuillet de lumière et le tour est joué.
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Dans une nouvelle étude, cette recette a été appliquée, non pas sur des organes, mais sur des embryons humains entiers. Ce qui a permis d’obtenir en trois dimensions une cartographie de toutes les structures, muscles, cartilages, glandes, une cinquantaine de types cellulaires, pour visualiser chaque cellule dans son environnement natif à différents stades de développement. C’est le premier atlas du genre - et plus qu’un simple outil, il nous renseigne déjà sur la formation de la tête. Alain Chédotal est l’investigateur principal de cette étude parue dans Cell : "On peut comme ça repérer quelques cellules dans leur environnement et donc on a pu notamment décrire le développement des glandes lacrymales. Donc, vous avez sous deux yeux, pendant le développement embryonnaire, des glandes qui vont pousser, qui après vont produire des larmes. C'est assez compliqué, c'est tout petit et donc cela n'avait pas pu être décrit correctement puisqu'il n'y avait pas de moyens de les visualiser facilement. C'est-à-dire qu'on ne savait pas quand toutes ces glandes qu'il y a dans la tête, nos têtes étaient pleines de glandes, il y a des glandes sous la langue, il y a des glandes dans les joues, il y a des glandes au niveau des yeux. On produit comme ça des tonnes de liquide, un litre de salive par jour au moins. Et ça, il n'y avait pas moyen vraiment de comprendre comment ça se développait. Et on a pu suivre comme ça la façon où ils s'arborisaient dans la tête."
L'individualité du développement révélée
Alain Chédotal : "Et là, ce qui est intéressant sur ces résultats-là, c'est qu'on s'est rendu compte que, en fait, tous les embryons qu'on a regardés sont différents. C'est-à-dire que globalement, ça forme une glande à la fin qui sera fonctionnelle, mais on peut penser que chacun d'entre nous, on a une structure de glande lacrymale, par exemple, qui est différente. Et puis ça, on peut le décliner sous tous les organes. Ce que nos travaux montrent, c'est qu'en fait, il y a globalement un plan de développement embryonnaire chez l'homme. Mais si on regarde dans le détail, dès le départ et très tôt, on parle de la 6e ou 7e semaine de développement, on commence déjà à voir des différences entre tous les individus."
Avec cette étude, nous touchons du doigt l’individualité du développement - ce qui fait que nous sommes des êtres semblables, avec un programme génétique commun tout en étant différents. Le but à présent est d’être de plus en plus précis, pour construire un socle commun à l'embryogenèse. Et ça s'inscrit dans un projet international plus vaste le Human Cell Atlas - l’Atlas Cellulaire Humain - un peu à l’image de ce qu’était le projet Genome Humain, pour cartographier les cellules humaines, les compter, comprendre leur diversité, afin d’avoir une vision générale de la formation des embryons et donc des êtres humains adultes, et ainsi élucider la genèse de certaines pathologies et malformations.
La méthode en détail
Pleine de mystère, l’anatomie de l’embryon est - par sa taille microscopique - très difficile à explorer. Mais des chercheurs français viennent de relever le défi en publiant des photos et des vidéos de cette petite graine post-mortem âgée de 6 à 14 semaines. « Plonger au cœur du vivant », « passer du dessin à la réalité »… c’est en ces termes que les chercheurs français* à l’origine de nouvelles images en 3D d’embryons âgés de 6 à 14 semaines - décrivent leur prouesse. L’équipe du Pr Alain Chédotal, coordinateur de l’étude, y est parvenu grâce à « la combinaison de deux techniques récente d’immuno-marquage : la microscopie en 3D et une [manipulation] permettant de rendre les tissus transparents ».
En pratique, les scientifiques ont commencé par localiser les organes en utilisant des anticorps fluorescents capables de se fixer sur les protéines des tissus. Ces derniers ont ensuite été « plongés dans plusieurs solvants pour éliminer les lipides membranaires et ne conserver que l’architecture des organes et ainsi permettre à la lumière de passer ». Troisième étape, grâce à un microscope et son laser épais de deux micromètres, les échantillons transparents ont été scannés. Ces techniques d’un degré de détails jamais égalé ont permis « d’obtenir des images du système nerveux périphérique, du système vasculaire, des poumons, des muscles ou encore du système urogénital ». Mais aussi « des nerfs sensitifs transmettant les signaux sensoriels aux cerveaux et des nerfs moteurs reliés aux muscles ».
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Ces clichés seront relayés sur un site créé en partenariat avec la Fondation Voir & Entendre. « L’objectif est d’en faire une banque internationale d’images pour disposer d’un véritable atlas en 3D de l’embryon humain au cours du premier trimestre de développement, avec une recherche possible organe par organe ».
Véritable salle du trône du corps humain, la tête abrite le cerveau, la plupart des organes sensoriels, et quantité de structures complexes, comme les glandes salivaires et lacrymales. Pourtant, les mécanismes impliqués dans son développement sont encore assez mal connus de nos jours. Or, parmi les nourrissons qui viennent au monde avec des anomalies congénitales, environ un tiers présentent des malformations de la tête.
La technique, appelée « transparisation », puisqu’elle permet de rendre les tissus transparents à la lumière puis de les photographier en trois dimensions, avait déjà été employée en 2017 pour observer l’anatomie d’embryons et de fœtus humains de 6 à 14 semaines. Elle a fait de nombreux progrès et a récemment été utilisée pour cartographier l’œil, un organe réputé difficile à étudier par transparisation car fragile et composé de nombreux tissus différents.
La transparisation s’appuie sur diverses techniques : pour obtenir la transparence voulue, les chercheurs plongent les tissus dans plusieurs solvants qui les déshydratent et débarrassent les cellules de leurs lipides membranaires, ce qui ne laisse que leur architecture interne, comme le cytosquelette et les protéines, et permet à la lumière de passer. Ils font ensuite appel à l’immunofluorescence pour identifier les organes cibles, et se servent d’un microscope spécial à feuillet de lumière pour l’imagerie 3D. Cette approche consiste en un laser de 3 micromètres d’épaisseur qui scanne les échantillons, puis les plans ainsi photographiés sont assemblés pour reconstituer une image tridimensionnelle de l’organe, par le biais de l’informatique.
Premiers résultats concrets et perspectives d'avenir
Image 3D obtenue au microscope à feuillet de lumière d’une glande lacrymale d’embryon humain de 12 semaines transparisé. Les biologistes ont appliqué cette technique à des embryons situés à plusieurs étapes de leur développement, et provenant de la banque de tissus humains du programme HuDeCa (Human Developmental Cell Atlas) de l’Inserm. Ce faisant, ils ont dressé la toute première carte en 3D de la tête humaine. Ils ont ensuite fait appel à la réalité virtuelle pour naviguer dans cette cartographie, ce qui leur a permis de découvrir des caractéristiques jusqu’alors méconnues du développement des muscles, des nerfs et des vaisseaux sanguins du crâne, et en particulier les premières étapes du développement des glandes lacrymales et salivaires, connues pour leur grande complexité structurelle, ou encore des artères du cou.
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Les données ont été mises à disposition sur une plateforme web, notamment pour la formation des étudiants et l’impression 3D. À l’avenir, l’équipe compte collaborer avec des médecins pour utiliser cette technique sur des prélèvements pathologiques. Une prouesse devenue possible grâce à la combinaison de deux techniques récentes d’immuno-marquage, de microscopie en 3D et une technique permettant de rendre les tissus transparents. Ces découvertes font l’objet d’une publication dans la revue Cell datée du 23 mars 2017.
Plonger au cœur du vivant. Passer du dessin à la réalité. Voilà ce qu’ont réalisé Alain Chédotal et ses collaborateurs grâce à leur nouvelle technique d’exploration de l’anatomie des embryons. Ils dévoilent dans la revue Cell, des photos inédites ainsi que des films en trois dimensions de plusieurs tissus et organes d’embryons et fœtus humains âgés de 6 à 14 semaines jusque-là inaccessibles.
Les livres de médecine ne manquent pas d’images d’embryons mais le constat est toujours le même : pour représenter leurs organes, on s’appuie uniquement sur des dessins. Quant aux moulages d’embryons détenus dans les facultés, ils sont en cire. Il faut dire que les modèles étaient basés jusqu’à ce jour sur l’analyse de fines coupes observées au microscope, nécessitant aux illustrateurs d’assembler et d’interpréter l’ensemble des données pour représenter un organe entier. Un procédé qui appartient au passé grâce à l’avènement de nouvelles méthodes d’imagerie en trois dimensions.
En pratique, les auteurs de ces travaux ont réussi à combiner trois techniques, immunofluorescence, clarification des tissus et observation microscopique pour pouvoir diffuser les premières images 3D réelles des tissus et organes d’embryons.
Ils ont d’abord eu recours à l’immunofluorescence pour marquer les organes intacts. Cette technique consiste à utiliser des anticorps fluorescents qui se fixent spécifiquement sur des protéines exprimées par certaines cellules permettant ainsi de les localiser. Ensuite, pour visualiser le signal fluorescent, ils ont rendu les tissus embryonnaires transparents grâce à une technique mise au point chez la souris en 2011. Pour cela, ils ont plongé les tissus dans plusieurs solvants qui ont permis de débarrasser les cellules de leurs lipides membranaires pour ne conserver que leur architecture/squelette protéique et permettre à la lumière de passer. Enfin, une fois ce travail accompli, ils ont utilisé un microscope spécial à feuillet de lumière. Image 3D du poumon humain embryonnaire. Les futures bronches et bronchioles (bleu et vert) sont visibles ainsi qui que les vaisseaux sanguins (rouge).
Le marquage par les anticorps des embryons a permis de révéler la présence des cellules recherchées et d’obtenir des images du système nerveux périphérique, du système vasculaire, des poumons, des muscles ou encore du système urogénital.
« Ce que nous avons observé a confirmé les données connues en embryologie mais c’est la première fois que nous obtenons des images réelles de l’organisation des tissus avec autant de détails. Nous avons notamment découvert des choses qu’il n’était pas possible de voir sans marquage spécifique. Nous avons par exemple réussi à distinguer les nerfs sensitifs (qui transmettent des signaux sensoriels vers le cerveau) des nerfs moteurs (qui sont reliés aux muscles), ce qui était alors impossible », explique Alain Chédotal.
Autre découverte : la variabilité de l’arborescence nerveuse au niveau des mains. Le développement des nerfs principaux est conservé dans toutes les mains mais celui des petites innervations périphériques est beaucoup plus aléatoire entre les mains gauche et droite et entre les individus. Enfin, dernier avantage souligné par les chercheurs : « nous pouvons avoir une idée du rythme de prolifération cellulaire pour chaque organe en comptant les cellules fluorescentes aux différents âges embryonnaires ».
Pour mettre ces données à la disposition du plus large public, l’équipe a créé un site internet dédié subventionné par la Fondation Voir & Entendre*. « Nous y proposons nos films libres d’accès et allons l’enrichir au fur et à mesure que nous en produirons de nouveaux. Nous aimerions également que d’autres laboratoires puissent le compléter avec leurs propres travaux. L’objectif est d’en faire une banque internationale d’images pour disposer d’un véritable atlas en 3D de l’embryon humain au cours du premier trimestre de développement, avec une recherche possible organe par organe.
Les embryoïdes : une alternative éthique pour la recherche
Les embryoïdes, issus de cellules souches, imitent le développement des premiers jours suivant la conception. L’Agence de la biomédecine propose une limite de vingt-huit jours de culture in vitro. Le 6 septembre, la revue Nature publiait une étude marquant une nouvelle avancée dans la fabrication in vitro de modèles d’embryons humains. Ceux-ci pourraient permettre de lever nombre d’inconnues sur les premières phases de notre développement en s’affranchissant pour partie du poids éthique pesant sur l’étude de vrais embryons. L’équipe de Jacob Hanna (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël), l’une des plus en pointe dans ce domaine, décrit avoir pu cultiver jusqu’au stade treize-quatorze jours un cocktail de cellules souches embryonnaires humaines. Plongées dans le milieu adéquat, celles-ci se sont spontanément multipliées pour former une entité cellulaire dont la croissance imite celle d’un véritable embryon, mais aussi des tissus destinés à favoriser son implantation dans un utérus - opération qui n’a bien sûr pas été conduite.
Cette nouvelle publication illustre les progrès rapides dans la mise au point de modèles d’embryons humains, ou embryoïdes, susceptibles de se substituer dans des projets de recherche aux embryons issus de fécondations in vitro, et ne faisant plus l’objet d’un « projet parental ». Ces embryoïdes sont capables de se développer jusqu’à des stades de plus en plus avancés de l’organogenèse, c’est-à-dire la formation de structures différenciées permettant le développement de l’embryon. Pour accompagner ces percées successives et guider les équipes françaises impliquées dans ces travaux, le conseil d’orientation de l’Agence de la biomédecine a rendu public mercredi 11 octobre un avis sur ces modèles d’embryons, dont les caractéristiques se rapprochent de plus en plus de celles de véritables embryons humains.
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