Introduction
La fécondation, étape cruciale de la reproduction sexuée, est initiée par une cascade d'événements complexes, parmi lesquels le signal calcique joue un rôle central. Cet article explore en profondeur le rôle du signal calcique lors de la fécondation, en mettant en lumière les mécanismes moléculaires impliqués, les différentes sources de calcium, les outils utilisés pour son étude, et son importance dans l'activation de l'ovocyte et le développement embryonnaire précoce.
Le Signal Calcique : Un Messager Universel
Dans toutes les espèces animales étudiées jusqu'à présent, une augmentation rapide et transitoire de la concentration intracellulaire en calcium libre (Cai) est observée dans l’ovocyte après la fécondation. Ce signal calcique est à la fois nécessaire et suffisant pour l’activation de l’ovocyte. Les concentrations cytosoliques de Ca2+ sont habituellement basses (de l’ordre de 100 nM, soit 20 000 fois moins environ que dans le milieu extracellulaire). L’augmentation de cette concentration, via l’ouverture de canaux sur le réticulum endoplasmique ou sur la membrane plasmique, accroît l’activité de certaines protéines et déclenche des cascades de signalisation. Selon le contexte cellulaire, ces variations de concentration calcique cytosolique peuvent varier en amplitude et en durée, et peuvent éventuellement osciller. Il existe une « signature calcique » propre à chaque stimulus et à chaque contexte cellulaire.
Sources et Mécanismes du Signal Calcique
Deux sources majeures d’ions Ca2+ permettent d’augmenter la concentration cytosolique :
- Une réserve interne de calcium dans le réticulum endoplasmique (et dans une moindre mesure dans la mitochondrie).
- Le milieu extracellulaire.
Le passage du Ca2+ d’un compartiment à l’autre dépend de l’activité de pompes et de canaux transmembranaires perméables au calcium.
Outils d'étude du signal calcique
Des molécules à la fluorescence augmentée par les ions Ca2+ sont devenues des outils précieux pour ce domaine de recherche. La première molécule à avoir été populaire dans les laboratoires est le Fura-2, un acide aminopolycarboxylique, découvert en 1986. Il absorbe à 340-380 nm (UV) et son émission à 510 nm dépend de la concentration calcique. Plus récemment, une protéine fusion entre la GFP, la calmoduline (une molécule de signalisation sensible à la concentration en Ca2+) et M13 (une courte séquence de la kinase de la chaine légère de la myosine) a été mise au point, GCamp. Une variante de l’outil précédent consiste à utiliser le FRET (transfert d’énergie par résonance). Le FRET ne fonctionne que si les deux molécules composant le couple FRET sont très rapprochées (< 10 nm). Les protéines dites caméléon consistent en une fusion de calmoduline liant Ca2+ à M13 et flanqué d’un côté par un GFP décalé vers le bleu et de l’autre côté par un GFP décalé des longueurs d’onde plus longues.
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Voies de Signalisation Calcique lors de la Fécondation
Plusieurs voies de signalisation, non exclusives et pouvant intervenir ensemble lors de la fécondation, ont été proposées pour expliquer comment, à partir du point de fusion avec l’ovocyte, le spermatozoïde déclenche ce signal.
Récepteurs et Ligands
Des molécules de la membrane plasmique du spermatozoïde (MPsp) peuvent être des ligands de récepteurs de la membrane de l’ovocyte (MPov) : fertiline, membre de la famille des ADAM (A disintegrin and metalloprotease domain) et qui a été clonée chez l’homme, cyritestine (ADAM3), éléments de la matrice extracellulaire (EM) comme la fibronectine, ces trois éléments étant des ligands d’intégrines, ou diverses autres molécules (X) telles que des protéines régulatrices du complément dont les récepteurs situés sur l’ovocyte sont inconnus.
Diverses intégrines sont exprimées à la surface de l’ovocyte et leur inhibition avec des anticorps ou des ligands spécifiques inhibent la fécondation, mais leur rôle reste à définir. Des souris femelles invalidées pour les intégrines de la famille β1, incluant les sous-unités α2, α3, α5, α6, α9, αv, ainsi que αvβ3 et αvβ5, sont fertiles.
Rôle des Canaux Calciques
Des canaux Cai de la membrane plasmique de l’ovocyte seraient activés lors de l’interaction avec le spermatozoïde, ce qui laisserait passer suffisamment de Cai dans l’ovocyte pour stimuler la libération de Cai du RE. Selon une autre hypothèse, la fusion des gamètes entraînerait une insertion de canaux Ca spermatiques au sein de la membrane plasmique de l’ovocyte. Un canal Ca de type TRP-3, exprimé dans le spermatozoïde humain, a été récemment impliqué dans les processus de fécondation chez C. elegans.
Le Facteur Spermatique
Des extraits spermatiques obtenus chez diverses espèces, des invertébrés jusqu’à l’homme, sont capables d’engendrer des oscillations calciques dans les ovocytes de souris, de hamster, humains ou d’oursin ou dans les cellules somatiques. Ce facteur spermatique serait donc universel et identique dans toutes les espèces, et soit soluble, soit insoluble et associé au matériel périnucléaire. L’oscilline et tr-kit ont été proposés, le rôle du premier ayant été définitivement invalidé, et aucune preuve définitive n’étayant celui du second. Une phospholipase C (PLC) a été purifiée puis clonée en 2002 chez la souris, puis isolée chez le singe et l’homme : PLCζ. PLCζ est la plus petite PLC connue à ce jour, montre une sensibilité très élevée au Ca, et induit des oscillations Cai exclusivement en phase M suite à sa localisation nucléaire. Chez l’homme, l’injection d’ARN complémentaire de PLCζ humaine dans des ovocytes qui ne sont pas activés après FIV ou ICSI induit la formation de blastocystes. PLCζ est à ce jour le meilleur candidat reconnu pour jouer le rôle de facteur spermatique. Cependant, il faudra s’assurer que PLCζ n’est pas également exprimée dans l’ovocyte, le niveau d’expression dans les ovaires ou les ovocytes n’ayant jamais été mesuré.
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Autres mécanismes de signalisation calcique
Soit directement comme dans le cas des récepteurs NMDA au glutamate dans le système nerveux qui sont des canaux à Ca2+. Ces récepteurs-canaux font entrer les ions Ca2+ quand le glutamate se lie à eux et que concomitamment, il y a une dépolarisation membranaire qui permet de chasser le Mg2+ de son site de liaison sur les récepteurs car sa présence empêche les ions Ca2+ de passer. Dans ce dernier cas, les acides gras à phosphatidylinositol jouent un rôle important dans les voies de signalisation menant à l’entrée du Ca2+ dans le cytosol. Deux acides gras hydrophobes ancrent le phosphatidylinositol à la membrane. Les PI3-kinases phosphorylent le cycle inositol du phosphatidylinositol bi-phosphate (PIP2) en position 3 donnant ainsi le PIP3. En plus d’être un substrat pour former le PIP3, PIP2 peut être la source de deux autres cofacteurs. La phospholipase C (PLC) est capable de cliver PIP2 en DAG (diacylglycérol) et en IP3 (inositol-1,4,5-trisphosphate) qui agissent en tant que seconds messagers. Tandis que le DAG reste à la membrane, l’IP3 est soluble dans l’eau et diffuse de la membrane vers le cytosol.
DAG est un cofacteur activateur de la protéine kinase C (PKC), une sérine/thréonine kinase. La PKC a été identifiée comme le substrat de l’ester de phorbol, un puissant promoteur de tumeur (Blumberg, 1988). La phospholipase C (PLC) peut être activée par des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G de type Gq/11. C’est le cas par exemple du récepteur à la GnRH dans les cellules de l’adénohypophyse qui contrôle la production et la sécrétion des hormones gonadotropes FSH et LH.
IP3 agit sur l’un des acteurs majeurs de la signalisation calcique, le réticulum endoplasmique (RE), en se fixant sur un récepteur IP3R à sa surface. Ces récepteurs sont constitués de 4 sous-unités formant un canal. Il existe 3 isoformes d’IP3Rs qui peuvent s’assembler en homo- ou en hétérotétramères. Ils diffèrent par leurs domaines de liaisons à l’IP3, et par leur domaine dit de modulation qui peut être affecté par des phosphorylations (par exemple par la PKA) et qui permet des interactions avec la calmoduline.
La sortie des ions Ca2+ du RE peut être couplée à une ouverture de canaux Ca2+ à la membrane plasmique par le mécanisme SOCE (pour store-operated Ca2+ entry). La réduction de la concentration de Ca2+ libre du RE provoque la dissociation du Ca2+ des sites de liaison dans la lumière du RE du Ca2+ de la protéine STIM1, une protéine dimérique intégrée dans les membranes du RE.
Une voie de signalisation Wnt non canonique aboutit à l’augmentation de la concentration de Ca2+ dans le cytosol. Les Wnt se fixent alors au co-récepteur tyrosine kinase Ryk. L’activation de la voie Wnt/Ca2+, une voie indépendante de la β-caténine, entraîne la libération de Ca2+ du réticulum endoplasmique (ER), qui active les protéines kinases CAMKII et PKC. Cette voie déclenche des événements en aval avec notamment l’activation des facteurs de transcription NFκB et CREB et la transcription de leurs gènes-cibles en aval.
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Dans les cellumes végétales, l’entrée du Ca2+ dans le cytosol peut aussi être l’aboutissement de voies de signalisation activées par différents stimuli, notamment la présence de molécules d’agents pathogènes appelés éliciteurs. Dans d’autres cas, cela peut être des molécules d’organismes symbiotiques qui provoquent une augmentation du calcium intracellulaire comme les facteurs Nod, des lipo-chito-oligosaccharides produits par les bactéries du genre Rhizobium lors de la formation des nodosités avec les Fabacées. Les facteurs Nod sont perçus par les récepteurs kinases NFR1/NFR5 qui déclenchent une cascade de signalisation aboutissant à l’entrée de Ca2+ (Harris et al., 2003; Gao et al., 2021).
Les canaux Ca2+ voltage-dépendants (VGCC pour Voltage-Gated Calcium Channels), exprimés dans les cellules excitables, sont de grands canaux transmembranaires qui subissent des changements de conformation en réponse à des modifications du potentiel membranaire. En potentiel de repos, ils sont généralement fermés. Les canaux calciques voltage-dépendants sont formés d’un complexe de plusieurs sous-unités différentes : α1, α2δ, β1-4 et γ. Au début du développement, les canaux calciques de type T (ou Cav3) s’expriment en grande quantité dans les neurones (activés par un voltage bas, effet transitoire). Au cours de la maturation du système nerveux, l’expression des canaux de type N ou L (Cav1 et Cav2, activés par un voltage élevé, effet long) devient plus importante.
Les terminaisons nerveuses présynaptiques des synapses présentent une forte densité de canaux calciques voltage-dépendants, le plus souvent des canaux Cav2.1 (type P/Q), Cav2.2 (type N), ou une combinaison des deux. L’arrivée d’un potentiel d’action dans la terminaison ouvre ces canaux, provoquant un afflux de Ca2+ qui déclenche la libération du neurotransmetteur par exocytose.
Dans les cellules musculaires, l’entrée de Ca2+ dans le cytosol en provenance de l’extérieur de manière voltage-dépendant déclenche une autre entrée provenant du réticulum sarcoplasmique (le réticulum endoplasmique lisse particulier des cellules musculaires) via les récepteurs à ryanodine RyR (de type L) qui se trouvent dans la membrane du réticulum sarcoplasmique. Cet apport de Ca2+ supplémentaire dans le cytosol est nécessaire à la contraction musculaire. Dans l’insuffisance cardiaque, les RyR peuvent être dysfonctionnels en raison de modifications post-traductionnelles qui aboutissent à une fuite d’ions Ca2+ du réticulum sarcoplasmique vers le cytosol, ce qui perturbe la succession contraction-relâchement des cardiomyocytes et aussi leur métabolisme.
Impact sur l'Activation de l'Ovocyte et le Développement Embryonnaire
L’ovocyte de mammifère fécondable est bloqué en métaphase de seconde division méiotique. Cet arrêt de la progression du cycle cellulaire est dû au maintien d’activités élevées de MAPK (M-phase activating protein kinase) et de MPF (mitosis promoting factor), le signal Cai généré lors de la fécondation provoquant l’inactivation de ces deux kinases et la sortie de méiose. Des défauts des voies de signalisation, soit à l’origine soit en aval de ce signal, pourraient donc avoir des répercussions sur les événements précoces du développement embryonnaire qui dépendent par exemple de ces deux activités.
Les oscillations de Cai, dont l’intensité et la fréquence dépendent de l’espèce, sont non seulement nécessaires et suffisantes pour la reprise de la méiose en métaphase II et l’activation du métabolisme, mais pourraient également contrôler le développement précoce de l’embryon.
Signal Calcique et ICSI
L’ICSI (intracytoplasmic sperm injection) est reconnue à ce jour comme étant l’approche thérapeutique la plus performante pour pallier une infertilité masculine sévère ou des échecs de FIV (fécondation in vitro). L’interaction du spermatozoïde au niveau de la membrane plasmique de l’ovocyte est court-circuitée pendant l’ICSI. Cela conforte l’hypothèse selon laquelle l’activation de l’ovocyte serait due à l’injection d’un (ou de plusieurs) facteur(s) contenu(s) dans le spermatozoïde et possédant les propriétés d’un oscillateur calcique. Cependant, il est possible que certaines voies de signalisation, normalement déclenchées au niveau de la membrane plasmique lors de l’interaction avec le spermatozoïde, ne soient pas activées après ICSI et puissent engendrer des anomalies au cours du développement embryonnaire.
Chez l’homme, les oscillations calciques sont observées aussi bien lors de FIV conventionnelles qu’après ICSI. Cependant, alors que les premiers pics calciques apparaissant après ICSI sont tronqués et retardés, les suivants se produisent de façon typique de ceux qui surviennent lors d’une fécondation normale. Lors d’une ICSI, le spermatozoïde, immobilisé puis récupéré dans la pipette d’injection, est injecté dans l’ovocyte en même temps que du cytoplasme de l’ovocyte préalablement aspiré, afin de s’assurer de la rupture de sa membrane plasmique, condition sine qua non du succès de la fécondation. Cette procédure déclenche un influx calcique - lequel peut être obtenu après injection de milieu sans spermatozoïde - mais ne provoque alors pas d’activation de l’ovocyte. Cet influx calcique provoqué après ICSI est donc nécessaire mais pas suffisant pour activer l’ovocyte. Il serait le signal « déclencheur » normalement activé lors de l’interaction entre les membranes plasmiques du spermatozoïde et de l’ovocyte.
Les méthodes d’immobilisation du spermatozoïde utilisées lors de l’ICSI (pipetage, écrasement, application piezo) influencent le démarrage des oscillations Cai. Elles endommagent la membrane plasmique du spermatozoïde, condition nécessaire pour libérer soit un facteur spermatique activateur soit des co-facteurs ou des substrats intervenant dans les oscillations Cai.
Le décours des oscillations Cai varie en fonction de la maturité de chacun des gamètes utilisés lors de l’ICSI.
Dysfonctionnements de l'Acrosome et Impact sur la Fécondation
L'acrosome, une vésicule d'origine golgienne située à l'extrémité du spermatozoïde, joue un rôle crucial dans la fécondation. Les enzymes qu'il contient, telles que l'hyaluronidase et l'acrosine, permettent au spermatozoïde de franchir les enveloppes de l'ovule (cumulus oophorus et zone pellucide). Pour libérer ces enzymes, le spermatozoïde doit effectuer la réaction acrosomique, un processus de fusion membranaire déclenché par une entrée de calcium.
Évaluation de la fonction acrosomique
L'étude de la fonction acrosomique est donc d'un grand intérêt dans l'évaluation de la fertilité masculine. Plusieurs techniques sont utilisées pour évaluer l'état de l'acrosome :
- Microscopie électronique: Permet une visualisation directe et fiable de l'acrosome.
- Marquage par lectines (PNA, PSA): Visualise la membrane acrosomique externe ou le contenu acrosomique. La perte de marquage indique la réaction acrosomique.
- Marquage par anticorps (GB24, MH61): Révèle la membrane acrosomique interne après la réaction acrosomique.
Induction de la réaction acrosomique
La réaction acrosomique peut être induite in vitro par différents agents :
- Calcium ionophore (A23187): Inducteur puissant, mais non physiologique, de la réaction acrosomique.
- Liquide folliculaire: Inducteur plus physiologique, mais moins puissant.
- Progestérone: Agit via des récepteurs membranaires et induit une entrée de calcium.
Implications cliniques
Des études ont montré que des anomalies de l'acrosome (morphologie, contenu) peuvent être associées à des échecs de fécondation in vitro (FIV). L'évaluation de la fonction acrosomique, en complément des paramètres spermatiques conventionnels, peut donc améliorer l'adéquation des choix thérapeutiques (FIV ou micro-injection).
Signalisation Calcique et Empreinte Génomique
Chaque cellule possède deux copies de chaque gène, d’origine maternelle et paternelle, mais il existe des gènes pour lesquels une seule des deux copies s’exprime, l’autre étant réprimée selon l’origine parentale : c’est ce qu’on appelle l’empreinte génomique. Avant la fécondation, un des allèles, maternel ou paternel, est rendu silencieux, puis transmis à la descendance dans cette configuration. Chez l’homme, ce processus est essentiel pour le développement du placenta et de l’embryon.
L’ensemble du génome subit des modifications épigénétiques lors de la gamétogenèse et pendant le développement embryonnaire selon trois processus: le mutisme des ARN correspondants, des modifications des histones, et la méthylation de l’ADN, celle-ci étant totalement effacée dans les cellules germinales puis ré-établie lors de la gamétogenèse. Après la fécondation, seuls les quelques gènes soumis à l’empreinte parentale restent méthylés. Pour la quasi-totalité du génome, non soumise à l’empreinte parentale, la déméthylation du génome paternel est activée dans les premières heures suivant la fécondation, puis elle est suivie d’une déméthylation passive du génome maternel.
Des défauts épigénétiques peuvent conduire à des pathologies majeures incluant des cancers, divers syndromes liés à des instabilités chromosomiques, et des retards mentaux.
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