Les avancées technologiques en matière de séquençage de nouvelle génération (NGS) offrent des perspectives inédites dans le domaine de la génétique embryonnaire, notamment en ce qui concerne l'étude des mitochondries et la prévention des maladies associées à des mutations de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Cet article explore les implications du NGS dans le contexte du diagnostic préimplantatoire (DPI) et du diagnostic prénatal (DPN) des cytopathies mitochondriales, tout en abordant les enjeux éthiques et les controverses liés aux techniques de modification génétique des embryons.
Introduction aux Mitochondries et à l'ADN Mitochondrial
Les mitochondries, organites cellulaires essentiels, jouent un rôle crucial dans la production d'énergie nécessaire au développement et au fonctionnement des cellules eucaryotes, y compris les cellules humaines. Elles possèdent leur propre génome, l’ADN mitochondrial (ADNmt), dont la transmission est exclusivement maternelle. Tous les gènes portés par l’ADNmt sont dédiés à la production de sous-unités des complexes de la chaîne respiratoire.
Les mutations de l’ADNmt, fréquentes en pathologie humaine, sont responsables de maladies sévères (les cytopathies mitochondriales) sans traitement curatif à ce jour. Elles ont la particularité d’être portées le plus souvent à l’état hétéroplasmique, c’est-à-dire que coexistent dans les différents tissus/cellules de l’individu, à la fois des molécules d’ADNmt mutées et sauvages, dont les quantités respectives définissent un taux d’hétéroplasmie. Seuls les taux d’hétéroplasmie élevés, dépassant un seuil, sont associés à une expression clinique. Ce taux seuil est cependant variable d’un tissu à l’autre, et d’une mutation à l’autre, voire d’un individu à un autre, expliquant, du moins en partie, l’hétérogénéité clinique intra et interfamiliale pour une mutation donnée, et compliquant considérablement le conseil génétique de ces affections.
Diagnostic Préimplantatoire et Prénatal des Cytopathies Mitochondriales
Les femmes porteuses d’une mutation de l’ADNmt ont un risque élevé de transmettre une maladie grave à leur descendance, et beaucoup font la demande d’une prise en charge en diagnostic prénatal (DPN) et/ou préimplantatoire (DPI). Ces procédures diagnostiques consistent à mesurer le taux d’hétéroplasmie fœtal ou embryonnaire, et à considérer que les embryons et les fœtus porteurs d’un taux d’hétéroplasmie inférieur au taux seuil de la mutation ont un risque faible de développer une cytopathie mitochondriale.
Cependant, la majorité des enfants nés après ce type de diagnostic sont porteurs de la mutation de l’ADNmt ce qui les expose à un risque résiduel de développer la maladie. De plus, certaines patientes ont très peu de chances de donner naissance à un enfant porteur d’un faible taux d’hétéroplasmie, dans la mesure où elles-mêmes portent un taux élevé de mutation, d’où un risque important d’interruption de grossesse en cas de DPN (50 % dans notre population) ou de non-transfert embryonnaire en cas de DPI.
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Le Séquençage de Nouvelle Génération (NGS) : Une Révolution Diagnostique
Le NGS, acronyme de l’anglais « Next Generation Sequencing », désigne le séquençage de nouvelle génération. Grâce au NGS, il est possible d’identifier les anomalies chromosomiques numériques (aneuploïdies) des embryons. Le NGS représente la technologie de dépistage chromosomique la plus récente et la plus complète.
Grâce au test NGS, les embryons obtenus par traitement de fécondation in vitro (FIV) sont analysés génétiquement de manière rapide et efficace, permettant de sélectionner les embryons sains pour le transfert. L’avantage majeur de la méthode NGS dans le traitement FIV est qu’elle augmente significativement les chances de grossesse par transfert et réduit les risques de fausse couche.
Grâce à la technologie de séquençage de nouvelle génération, il est possible d’examiner les 24 chromosomes (dépistage chromosomique complet). Les embryons présentant des anomalies chromosomiques sont identifiés avant leur transfert dans l’utérus, augmentant ainsi les chances de grossesse en transférant uniquement les embryons sains.
Le dépistage génétique préimplantatoire basé sur le NGS est effectué sur des embryons ayant atteint le stade de blastocyste. Une biopsie embryonnaire est réalisée en prélevant quelques cellules des trophoblastes de l’embryon au stade blastocyste.
Avantages et Caractéristiques du Test NGS
- Augmentation des taux de transfert et de grossesse: La sélection des embryons chromosomiquement normaux augmente les chances de grossesse après transfert.
- Précision accrue par rapport aux autres tests génétiques: Le risque de faux négatif est réduit à environ 5 %.
Il est recommandé d'utiliser la méthode NGS aux patientes de plus de 35 ans suivant un traitement FIV. Avec l’âge, le risque que les embryons ne soient pas génétiquement normaux augmente. Alors que ce risque est inférieur à 40 % chez les femmes de moins de 35 ans, il dépasse 70 % chez celles de plus de 42 ans.
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Alternatives et Nouvelles Techniques d'Édition du Génome
Les nouvelles techniques d’édition du génome comme les enzymes TALEN (transcription activator-like effector nuclease), le système CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas 9, voire les ARN anti-réplicatif, pourraient être appliquées aux embryons in vitro, dans le but de diminuer leur taux d’hétéroplasmie. Cependant, pour les patientes homoplasmiques (qui sont porteuses uniquement de molécules d’ADNmt mutées), ces options ne sont pas applicables. La plupart d’entre elles se tournent alors vers le don d’ovocytes.
C’est dans ce contexte que des équipes ont développé une procédure alternative : le don de cytoplasme. Le don de cytoplasme offre à ces femmes la possibilité de transmettre les caractères héréditaires portés par leur génome nucléaire à un enfant sans lui transmettre leur mutation de l’ADNmt. Cette procédure aboutit ainsi à la mise en présence des génomes nucléaires parentaux avec le génome mitochondrial d’une donneuse, d’où le malheureux nom donné à cette technique de « fécondation in vitro (FIV) à 3 parents ». Très débattue au niveau international, cette procédure reste particulièrement controversée en France.
Le Transfert Nucléaire : Une Approche Controversée
La première application de transfert nucléaire sur des embryons humains a été rapportée en 2010 par l’équipe de Craven et al à Newcastle, avec le transfert de pronoyaux entre des zygotes anormaux (mono et/ou trinucléés). La procédure a consisté à prélever un karyoplaste contenant les pronoyaux d’un zygote A, et à le transférer sous la zone pellucide d’un zygote B préalablement énucléé, donneur de cytoplasme, puis à fusionner les membranes grâce à la protéine virale inactivée du virus Sendaï (ou HVJ pour hemagglutinating virus of Japan). Le développement in vitro des zygotes ainsi reconstruits a été suivi jusqu’au stade de blastocyste. Le taux d’hétéroplasmie mesuré sur les embryons issus de cette reconstruction a montré une très faible contamination par l’ADNmt du zygote A (moins de 2 %), transféré de façon artéfactuelle avec le karyoplaste.
Récemment, la même équipe a appliqué cette procédure à des zygotes humains normaux (diploïdes) et a montré i) que le taux d’ADNmt contaminant restait faible, ii) que les embryons dérivés ne présentaient pas un excès d’anomalies chromosomiques, et iii) qu’ils avaient un profil d’expression génique comparable aux témoins. Cependant, la culture de cellules souches embryonnaires dérivées à partir de cinq embryons ainsi reconstitués, était associée dans un cas à une réversion génétique aboutissant à une colonisation de la lignée par l’ADNmt issu du karyoplaste, ADN qui devenait alors très rapidement majoritaire. Bien que le modèle de cellules souches embryonnaires ne reste qu’un modèle d’étude in vitro, ce résultat suggère qu’au cours de l’embryogenèse, une réversion génétique est possible.
Le prélèvement précautionneux du matériel génétique nucléaire des parents peut être réalisé à partir d’un zygote (prélèvement des pro-noyaux 6 heures après la fécondation) ou d’un ovocyte (prélèvement du fuseau méiotique avant la fécondation). Le transfert nucléaire entre ovocytes en métaphase de deuxième division méiotique semble une alternative efficace, une équipe ayant obtenu la naissance de deux singes rhésus porteurs de moins de 3 % d’ADNmt du karyoplaste. Très récemment, cette procédure a été appliquée à des ovocytes humains porteurs de mutations de l’ADNmt. Les embryons résultant de ce transfert au stade préimplantatoire portaient des taux d’ADNmt contaminant très faibles (moins de 1 %). Cependant, la culture de cellules souches embryonnaires issues de ces embryons a confirmé la possibilité de réversions génétiques (dans 3 lignées sur 18). Ces observations soulèvent la question de possibles reversions génétiques in vivo, et donc du devenir des embryons/fœtus issus d’une telle procédure. Elles ne font que renforcer les incertitudes qui avaient été émises autour du don de cytoplasme.
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Dialogue Nucléo-Mitochondrial et Risques Potentiels
Les premières incertitudes sont effectivement nées de l’observation de modèles de souris congéniques, c’est-à-dire porteuses d’un même ADN nucléaire et d’ADNmt qui diffèrent par une vingtaine de bases (polymorphismes). Des lignées de souris A et B ont été croisées successivement jusqu’à aboutir à la naissance de souriceaux porteurs dans leur génome nucléaire des gènes de la lignée B, et dans leur génome mitochondrial, des gènes de la lignée A, et réciproquement. Le phénotypage de ces nouvelles lignées de souris montre que des ADNmt différents, en interaction avec un même génome nucléaire, sont capables de modifier les apprentissages, les capacités exploratrices, le développement sensoriel, et l’anatomie cérébrale de ces animaux. Une étude très récente a montré par ailleurs que l’échange des ADNmt entre 2 lignées de souris peut s’accompagner d’une amélioration de leur état de santé au fil du temps (en particulier, diminution des cas d’obésité, de diabète, et médiane de durée de vie allongée).
Ces études montrent que des ADNmt différents, en interaction avec un même génome nucléaire, sont capables de modifier des fonctions cognitives essentielles. Elles soulignent l’importance de l’existence d’un dialogue nucléo-mitochondrial qui reste encore très mal connu. Pourtant ce dialogue a déjà été mis en cause dans l’expression phénotypique d’une mutation localisée dans un gène nucléaire. Le phénotype « surdité » de souris mutées dans le gène Ahl (age-related hearing loss gene), ne s’exprime en effet qu’en cas de co-mutation touchant un gène mitochondrial codant l’ARNt-Arg. Chez l’humain, la pénétrance, incomplète des mutations de l’ADNmt responsables de la neuropathie optique de Leber, serait liée à l’existence d’un ou plusieurs gènes nucléaires modificateurs localisés sur le chromosome X. En conclusion, le transfert nucléaire qui aboutit à l’introduction d’un génome « étranger » dans la cellule, pourrait modifier brutalement le dialogue mitochondries-noyau et être source de dysfonctionnements cellulaires.
Indépendamment de l’implication du génome nucléaire, il est possible que l’état « hétéroplasmique » soit délétère par lui-même. En effet, chez les mammifères, deux phénomènes se conjuguent pour maintenir un état homoplasmique. D’une part, la transmission monoparentale de l’ADNmt assure, en dehors du cas particulier des mutations touchant cet ADN, un état homoplasmique chez les enfants d’un couple. D’autre part, le phénomène de bottleneck, observé à de multiples reprises chez différents mammifères, et qui correspond à une restriction importante du nombre de mitochondries fondatrices d’un individu à un moment donné de l’ovogenèse chez la femme/femelle, induit une perte de variance génétique à la génération suivante. Or le transfert nucléaire induit de facto un état hétéroplasmique, car le transfert de karyoplaste s’accompagne toujours d’un transfert artéfactuel de mitochondries.
Des études menées sur des modèles murins suggèrent que l’hétéroplasmie par elle-même serait source de dysfonctionnements cellulaires. Les souris nées après transfert cytoplasmique entre 2 espèces de souris porteuses de séquences d’ADNmt qui diffèrent par quelques polymorphismes, mais sans pathologie associée, peuvent développer de l’hypertension artérielle, des modifications cardiaques en rapport avec une hypertension pulmonaire, une augmentation de la masse et de la graisse corporelles, et présentent des anomalies électrolytiques et hématologiques. Une étude plus récente a montré que des souris hétéroplasmiques présentent une réduction de leur consommation alimentaire et des échanges respiratoires, une réponse accentuée au stress, une réduction de leur activité et même, une déficience cognitive par rapport à leur contrôle homoplasmique.
Enjeux Éthiques et Considérations Futures
Ces risques pourraient être considérés comme faibles comparés au bénéfice apporté par l’application du don de cytoplasme en terme de prévention des maladies graves résultant de mutations de l’ADNmt. Cependant, certaines équipes envisagent de proposer le transfert de fuseau méiotique (ovocyte) ou de pronoyaux (zygote) comme aide à la reproduction humaine, afin de pallier les effets de l’âge de la femme sur la qualité de l’ovocyte. En effet, plusieurs études ont montré l’importance de facteurs cytoplasmiques (dont la mitochondrie) dans la compétence ovocytaire. Ces procédures pourraient ainsi être proposées à des femmes de plus de 38 ans, ou en échec de grossesse après fécondation in vitro. Une équipe a déjà réalisé un transfert nucléaire pour un couple qui avait pour antécédent un arrêt de développement embryonnaire précoce, au stade de 2 cellules. Le sperme du conjoint a été utilisé pour la fécondation des ovocytes de la mère et de la donneuse d’ovocytes. Le transfert nucléaire a été réalisé pour 7 zygotes et 5 embryons ont été « reconstruits ».
La connaissance de plus en plus fine de notre génome puis sa manipulation vont réduire le fardeau génétique des nouvelles générations. Ainsi, le séquençage des foetus a été accepté par le Comité national d'éthique français. Plus troublant, la modification génétique des bébés va progressivement s'imposer. L'ingénierie des ovules constitue une étape cruciale de ce processus.
Les pouvoirs de l’Homme sur la nature ont énormément augmenté. Il est ainsi possible de faire naître un bébé conçu à partir de l’ADN de trois personnes, de créer des embryons mi-homme mi-porc ou de modifier les gènes humains avec CRISPR-Cas9. Ces pratiques sont susceptibles d’avoir des conséquences pour soi, mais aussi pour autrui, voire pour l’humanité. Elles intéressent donc tout un chacun. La communauté juridique doit pouvoir intervenir dans les débats et éventuellement participer à la régulation de ce que permet l’innovation notamment concernant l’embryon humain. Les biotechnologies, c’est-à-dire l’alliance des sciences de la vie et de la technique, offrent à l’Homme d’immenses pouvoirs qui lui permettent de se modifier lui-même.
Ambiguïtés Terminologiques et Défis Juridiques
Face aux possibilités offertes par les nouvelles technologies quant à la modification de l’embryon, si l’on veut responsabiliser l’ensemble des acteurs concernés, il faut éviter toute ambiguïté relative à une terminologie souvent équivoque. Tout d’abord, qu’est-ce qu’un embryon transgénique ? Si l’on s’en tient à la définition proposée par le dictionnaire Larousse, la transgénèse consiste à modifier « [le] génome d’un être vivant par introduction d’un fragment d’ADN au stade d’ovule ou de jeune embryon, au cours d’une expérience ». Des précisions sont apportées pour la transgénèse végétale. Il s’agit de « la modification héréditaire d’un génome à la suite de l’intégration et de l’expression d’un gène étranger ». Il résulte donc de ses définitions qu’un organisme est transgénique dès lors qu’on a ajouté un fragment d’ADN au génome d’un organisme. La suppression d’une séquence d’ADN est donc insuffisante pour considérer l’organisme comme transgénique. L’origine du fragment d’ADN ajouté n’est cependant pas précisée. Or, le qualificatif « étranger » retenu dans la définition génère beaucoup d’incompréhension.
Pour les biologistes, un organisme génétiquement modifié est qualifié de transgénique s’il a reçu un ou plusieurs transgène(s) et classiquement, un transgène est défini comme un fragment d’ADN étranger à l’organisme « travaillé » qui est inséré dans le génome de cet organisme. Cette séquence d’ADN peut soit conférer une nouvelle information au génome de l’organisme « hôte », soit modifier l’information génétique existant dans ce génome, soit supprimer une information. L’origine de la séquence d’ADN qui est introduite n’est pas précisée, mais il est certain qu’il y a transgène lorsque le fragment provient d’un autre organisme que celui qui est travaillé. C’est pourquoi les scientifiques retiennent l’expression de matériel génétique exogène.
En réalité, il serait envisageable de retenir la qualification de transgène pour désigner tout fragment d’ADN inséré dans le génome de l’organisme et cela même si ce fragment provient de l’organisme travaillé lui-même et n’a pas été modifié. En effet, pour qu’il y ait transgénèse, il suffirait que de l’ADN soit ajouté dans le génome receveur. Actuellement, s’agissant de la transgénèse animale, on identifie un gène d’intérêt responsable de la caractéristique que l’on veut transférer à l’organisme receveur. Puis, on adapte ce gène afin qu’il puisse être intégré au génome receveur. Même si l’on souhaitait intégrer un gène de l’organisme receveur pour qu’il se multiplie, en l’état des connaissances techniques, il serait nécessaire de modifier le gène afin d’augmenter sa fréquence d’insertion dans le génome d’origine et d’obtenir une multiplication du nombre de copies. C’est pourquoi les transgènes sont dits exogènes.
Que l’on adhère ou non à cette analyse, l’intégration d’ADN dans le génome est essentielle pour qu’il y ait transgénèse. Il s’ensuit que si on introduit de l’ARN (acide ribonucléique), l’organisme ne sera pas « transgénique ». De même, pour la majorité des biologistes, l’ajout d’une seule paire de bases au génome d’un organisme ne constituant pas une séquence d’ADN, l’organisme ainsi modifié ne serait pas transgénique. Toutefois, sur ce point, il est encore possible de discuter. D’aucuns estiment que le nombre de paires de bases modifiées importe peu. La qualification d’organisme transgénique dépendrait du mode d’obtention de l’organisme modifié génétiquement bien plus que du nombre de paires de bases modifiées.
Concernant le droit, un embryon transgénique serait un embryon dont le génome a été modifié par l’ajout d’un ou plusieurs fragments d’ADN n’appartenant pas à l’embryon modifié, qu’il soit d’origine humaine ou animale. Cette définition n’écarte pas la discussion sur le nombre de paires de bases qui permet de considérer qu’un organisme est transgénique, mais en toute hypothèse, elle confirme qu’il y a un ajout dans le génome de l’organisme travaillé. Cependant, sur le site officiel des États généraux de la bioéthique, il est précisé « [qu’]on entend par embryons transgéniques des embryons dans le génome desquels une ou plusieurs séquences d’ADN n’appartenant pas à l’embryon lui-même ont été ajoutées ou supprimées ». Cette phrase ne permet pas de mieux saisir le sens du mot transgénique, bien au contraire. Qu’est-ce qui a été supprimé ? Si l’on s’en tient aux mots : « une ou plusieurs séquences d’ADN n’appartenant pas à l’embryon lui-même ». Si tel est le cas, ces séquences ont préalablement été ajoutées au génome et cela suffit à qualifier l’embryon de transgénique. Une interprétation plus large de la phrase pourrait être de dire qu’une modification du génome par suppression d’un fragment d’ADN appartenant à l’embryon suffit pour qu’il y ait transgène. Mais alors, la définition de la transgénèse est remise en cause en ce sens qu’elle ne repose plus sur un ajout au niveau du génome.
Concernant la transgénèse, une autre imprécision est susceptible d’embarrasser les juristes. Jusqu’alors, la transgénèse ne concernait que l’ADN nucléaire, c’est-à-dire l’ADN contenu dans le noyau d’une cellule. Or, la conception d’un bébé à partir de 3 ADN conduit à s’interroger sur la modification de l’ADN mitochondrial. Il s’agit de l’ADN extranucléaire contenu dans les mitochondries présentes dans toutes les cellules eucaryotes et notamment dans les cellules humaines. L’ADN mitochondrial ne se situe pas dans le noyau de la cellule et n’est à l’origine d’aucun des traits potentiels de l’enfant auxquels les parents sont généralement attentifs. En effet, les mitochondries sont des organites cellulaires dont la fonction principale est de produire l’énergie nécessaire à la cellule pour se développer. Lors de la fécondation, les mitochondries de l’embryon sont transmises uniquement par les ovocytes de la mère. L’ADN mitochondrial est donc d’origine exclusivement maternelle. En quantité, il représente 1 % environ de l’ADN total contenu dans une cellule d’un organisme. Bien que présent en faible proportion, des mutations de cet ADN mitochondrial peuvent être responsables de nombreuses maladies sévères.
Aussi, pour permettre à une femme d’avoir un enfant en bonne santé, une équipe médicale a utilisé l’ovule d’une autre femme auquel elle a enlevé le noyau pour ne conserver que les mitochondries saines. Le noyau a été remplacé par celui de la future mère dont les mitochondries étaient défectueuses. L’ovule ainsi modifié a été fécondé par les spermatozoïdes du père in vitro et a fait l’objet d’un transfert. L’enfant a donc été conçu à partir de trois ADN : celui de son père, celui de sa mère et celui d’une autre femme qui a donné les mitochondries. Plus précisément, l’enfant a un seul génome nucléaire constitué du brassage du matériel génétique des parents biologiques, alors que l’ADN extranucléaire mitochondrial provient d’une donneuse. Selon certains auteurs, il n’y a pas de transgénèse dans la mesure où aucune séquence d’ADN n’est intégrée au génome nucléaire de l’enfant. Selon eux, la transgénèse se limite à l’ajout d’une séquence d’ADN nucléaire exclusivement. Dans le cas présent, il n’y a eu aucune modification de l’ADN nucléaire, mais apport d’une cellule vidée de son propre noyau. L’expression d’embryon chimérique n’est pas plus précise.
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