Introduction
Le développement embryonnaire est un processus complexe et finement orchestré, où chaque étape est régulée par des signaux moléculaires précis. Parmi ces signaux, le facteur de croissance des fibroblastes 8 (FGF8) joue un rôle essentiel dans la morphogenèse de divers organes et tissus chez la souris. Cet article explore en détail le rôle de FGF8 dans le développement embryonnaire de la souris, en mettant l'accent sur son implication dans la formation du néocortex et de l'œil.
Développement du Néocortex Cérébral
Organisation et Composition du Néocortex
Le néocortex cérébral, structure clé du cerveau des mammifères, se développe à partir du télencéphale. Il est constitué de deux principales classes de neurones : les neurones glutamatergiques excitateurs et les interneurones GABAergiques inhibiteurs. Les neurones glutamatergiques, majoritaires (70 à 80 %), sont principalement des neurones pyramidaux, caractérisés par leur morphologie conique et leurs arborisations dendritiques. Ils sont répartis en six couches, chacune présentant des patrons uniques d'expression génique, de morphologie et de connexions. Les interneurones GABAergiques, qui représentent environ 25 % des neurones, sont subdivisés en de nombreux types selon l'expression des gènes, la morphologie, la connectivité et les propriétés physiologiques.
Neurogenèse et Rôle des Cellules Gliales Radiaires
Les neurones (et les cellules gliales) sont générés à partir de cellules souches neuronales, appelées cellules de la glie radiaire apicale (aRG). Ces cellules souches peuvent subir une division symétrique, générant deux cellules souches, ou une division asymétrique, où l'une des cellules reste une cellule souche et l'autre devient un précurseur qui se différencie en neurone ou en cellule gliale. La dynamique des mitochondries joue un rôle crucial dans la régulation de la neurogenèse. Les cellules de la glie radiaire possèdent des mitochondries tubulaires pendant l'interphase, qui subissent une fission mitochondriale pendant la mitose. Après la mitose, les cellules qui subissent une fusion mitochondriale restent des cellules souches neurales, tandis que celles qui conservent des mitochondries fragmentées deviennent des neurones.
Signalisation et Facteurs de Croissance
Le cil primaire des cellules de la glie radiaire baigne dans le liquide céphalo-rachidien, dont la composition varie au cours du temps. Initialement enrichi en Sonic Hedgehog (Shh), sa concentration diminue tandis que la concentration en acide rétinoïque augmente. L'activation de la voie Shh élargit la population de cellules souches, en présence d'une activation de la voie Notch. La prolifération des cellules de la glie radiaire est également régulée par le calcium. Des augmentations de concentrations calciques transitoires se propagent à travers les cellules de la zone ventriculaire grâce à des jonctions gap, initiées par la signalisation purinergique via les récepteurs métabotropiques P2Y1.
Migration Neuronale et Formation des Couches Corticales
Les neurones se développent par vagues de neurogenèse, migration radiale et différenciation à partir des progéniteurs gliaux radiaux de la zone ventriculaire et des cellules progénitrices intermédiaires de la zone sous-ventriculaire. Les six couches du cortex sont générées de manière inversée, les neurones les plus précoces occupant les couches les plus profondes et les derniers neurones produits occupant les couches les plus superficielles. La migration radiale des nouveaux neurones est réalisée par la succession de plusieurs cycles de formation d'une protrusion frontale suivie par une nucléokinèse, c'est-à-dire le déplacement du noyau à l'intérieur du cytoplasme.
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Développement de l'Oeil
Induction et Morphogenèse de l'Oeil
Le développement de l'œil commence par l'expression d'un ensemble de facteurs de transcription dans le champ oculaire de la plaque neuroectodermique. Parmi ces facteurs, Six3 et Rax jouent des rôles particulièrement notables. La signalisation en provenance du mésoderme pré-chordal, notamment Shh, divise le champ oculaire unique en une moitié droite et une moitié gauche. Ensuite, se forment deux vésicules optiques autour de la 4ème semaine du développement humain. La région distale de la vésicule optique s'invagine pour former une structure en forme de coupe, la cupule optique.
Rôle de FGF8 dans l'Induction du Cristallin
La vésicule optique envoie des signaux inducteurs vers l'épiderme de la placode du cristallin : BMP4, FGF8 et Delta. L'épiderme avait déjà été rendu compétent à ces signaux au préalable. La placode du cristallin envoie en retour des FGF qui activent la formation de la coupe optique, laquelle envoie en retour d'autres FGF qui provoquent l'invagination de la placode. La signalisation FGF est donc nécessaire pour la formation de la placode du cristallin. La déplétion génétique des deux récepteurs Fgfr1/2 conduit à une placode cristalline plus fine et à l'absence des marqueurs du cristallin, Prox1 et αA-cristalline, indiquant un défaut de développement important après le stade d'induction du cristallin.
Développement de la Rétine
La rétine et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) sont formés respectivement à partir des parois externe et interne de la vésicule optique et commencent à exprimer des facteurs de détermination différents : Vsx2 pour la rétine et Mitf pour le RPE. La rétine des vertébrés est composée de cinq grands types de cellules neuronales et de trois types de cellules gliales, organisés en trois couches différentes. Initialement, la rétine n'est formée que d'une couche cellulaire externe (dite zone nucléaire) et une couche acellulaire interne.
Marquage de FGF8 dans l'Embryon de Souris: Protocoles et Applications
Importance du Marquage de FGF8
Le marquage de FGF8 dans l'embryon de souris est crucial pour comprendre son rôle précis dans le développement. Il permet de visualiser la localisation et l'expression de FGF8, ainsi que d'identifier les cellules et les tissus cibles de sa signalisation. Ces informations sont essentielles pour décrypter les mécanismes moléculaires qui régissent la morphogenèse et la différenciation cellulaire.
Protocoles de Marquage de FGF8
Plusieurs techniques peuvent être utilisées pour marquer FGF8 dans l'embryon de souris, notamment :
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- Immunohistochimie (IHC) et Immunofluorescence (IF) : Ces techniques utilisent des anticorps spécifiques dirigés contre FGF8 pour détecter sa présence dans les tissus embryonnaires. L'IHC utilise une enzyme pour révéler la liaison anticorps-antigène, tandis que l'IF utilise un fluorophore.
- Hybridation in situ (HIS) : Cette technique permet de détecter l'ARN messager (ARNm) de FGF8 dans les cellules, fournissant des informations sur l'expression du gène FGF8.
- Souris rapportrices : Des souris génétiquement modifiées peuvent être utilisées pour exprimer un gène rapporteur (par exemple, la GFP) sous le contrôle du promoteur de FGF8, permettant de visualiser les cellules exprimant FGF8.
Immunohistochimie et Immunofluorescence: Protocole Détaillé
- Préparation des tissus :
- Fixation : Prélever les embryons de souris aux stades de développement souhaités. Fixer les tissus dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant une durée appropriée (par exemple, une nuit à 4 °C). La fixation est essentielle pour préserver la morphologie cellulaire et empêcher la dégradation des protéines.
- Inclusion : Déshydrater les tissus en les passant dans des solutions d'éthanol de concentrations croissantes (par exemple, 50 %, 70 %, 90 %, 100 %). Ensuite, les inclure dans de la paraffine en les immergeant dans du xylène (ou un substitut) puis dans de la paraffine fondue. L'inclusion en paraffine permet de réaliser des coupes fines et régulières.
- Coupe : Réaliser des coupes fines (par exemple, 5 à 10 µm d'épaisseur) à l'aide d'un microtome. Déposer les coupes sur des lames de verre traitées pour favoriser l'adhérence des tissus.
- Déparaffinage et Réhydratation :
- Déparaffinage : Immerger les lames dans du xylène (ou un substitut) pour éliminer la paraffine. Répéter cette étape plusieurs fois.
- Réhydratation : Réhydrater progressivement les coupes en les passant dans des solutions d'éthanol de concentrations décroissantes (par exemple, 100 %, 90 %, 70 %, 50 %) puis dans de l'eau distillée.
- Récupération Antigénique (si nécessaire) :
- Dans certains cas, la fixation peut masquer les épitopes des protéines cibles, rendant difficile la liaison des anticorps. La récupération antigénique permet de restaurer l'accessibilité des épitopes.
- Méthodes : Il existe différentes méthodes de récupération antigénique, telles que le chauffage des lames dans un tampon spécifique (par exemple, citrate de sodium) au micro-ondes, à la vapeur ou dans un bain-marie. Le choix de la méthode dépend de l'anticorps utilisé et des recommandations du fabricant.
- Blocage :
- But : Bloquer les sites de liaison non spécifiques pour réduire le bruit de fond.
- Méthode : Incuber les lames avec une solution de blocage contenant du sérum (par exemple, sérum de chèvre ou de mouton) correspondant à l'espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été produit. Ajouter également du BSA (albumine de sérum bovin) et du Tween-20 pour minimiser les liaisons non spécifiques.
- Incubation avec l'Anticorps Primaire :
- Dilution et Incubation : Diluer l'anticorps primaire anti-FGF8 dans une solution de blocage appropriée, en suivant les recommandations du fabricant. Incuber les lames avec cette solution pendant une durée optimale (par exemple, une nuit à 4 °C).
- Anticorps : Choisir un anticorps primaire de haute qualité, validé pour l'IHC ou l'IF, et spécifique à FGF8.
- Lavage :
- Laver les lames plusieurs fois avec un tampon approprié (par exemple, PBS ou TBS) pour éliminer l'anticorps primaire non lié.
- Incubation avec l'Anticorps Secondaire :
- Dilution et Incubation : Diluer l'anticorps secondaire (conjugué à une enzyme ou à un fluorophore) dans une solution de blocage appropriée. Incuber les lames avec cette solution pendant une durée optimale (par exemple, 1 heure à température ambiante).
- Anticorps : Choisir un anticorps secondaire qui reconnaît l'anticorps primaire utilisé. Pour l'IHC, l'anticorps secondaire est conjugué à une enzyme telle que la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP). Pour l'IF, l'anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore tel que l'Alexa Fluor 488, l'Alexa Fluor 594 ou le Cy3.
- Lavage :
- Laver les lames plusieurs fois avec un tampon approprié pour éliminer l'anticorps secondaire non lié.
- Révélation (pour IHC) :
- Substrat : Incuber les lames avec un substrat spécifique à l'enzyme utilisée (par exemple, DAB pour la HRP ou BCIP/NBT pour l'AP). Le substrat réagit avec l'enzyme pour produire un précipité coloré visible au microscope.
- Contrôle : Surveiller attentivement la réaction pour éviter un marquage excessif.
- Contre-coloration (facultatif) :
- Réaliser une contre-coloration des noyaux cellulaires avec un colorant tel que l'hématoxyline pour améliorer la visualisation de la structure tissulaire.
- Montage :
- Déshydratation : Déshydrater les lames en les passant dans des solutions d'éthanol de concentrations croissantes puis dans du xylène (ou un substitut).
- Montage : Monter les lames avec un milieu de montage approprié pour préserver le marquage et protéger les coupes.
- Observation et Analyse :
- Observer les lames au microscope (optique pour l'IHC, à fluorescence pour l'IF) et analyser les résultats. Prendre des photos des régions d'intérêt et quantifier le marquage si nécessaire.
Hybridation In Situ: Protocole Détaillé
- Préparation des tissus :
- Suivre les mêmes étapes de fixation, inclusion et coupe que pour l'IHC et l'IF.
- Déparaffinage et Réhydratation :
- Suivre les mêmes étapes de déparaffinage et réhydratation que pour l'IHC et l'IF.
- Pré-traitement des tissus :
- Perméabilisation : Traiter les coupes avec de la protéinase K pour perméabiliser les membranes cellulaires et faciliter l'accès de la sonde d'hybridation à l'ARNm.
- Acétylation : Acétyler les coupes pour réduire le bruit de fond.
- Préparation de la sonde :
- Conception de la sonde : Concevoir une sonde d'hybridation complémentaire à la séquence d'ARNm de FGF8. La sonde peut être un oligonucléotide ou un ARN.
- Marquage de la sonde : Marquer la sonde avec un isotope radioactif (par exemple, 33P), un ligand (par exemple, digoxigénine) ou un fluorophore.
- Hybridation :
- Préchauffage : Préchauffer les lames et la sonde à la température d'hybridation.
- Hybridation : Appliquer la sonde d'hybridation sur les coupes et incuber dans une chambre humide à la température d'hybridation pendant une durée optimale (par exemple, une nuit).
- Lavage :
- Laver les lames plusieurs fois avec des solutions de lavage de différentes stringences pour éliminer la sonde non hybridée.
- Détection :
- Détection autoradiographique : Pour les sondes marquées avec un isotope radioactif, exposer les lames à un film autoradiographique pour visualiser le signal.
- Détection immunohistochimique : Pour les sondes marquées avec un ligand, incuber les lames avec un anticorps spécifique au ligand, suivi d'une révélation enzymatique ou fluorescente.
- Contre-coloration (facultatif) :
- Réaliser une contre-coloration des noyaux cellulaires pour améliorer la visualisation de la structure tissulaire.
- Montage :
- Monter les lames avec un milieu de montage approprié.
- Observation et Analyse :
- Observer les lames au microscope et analyser les résultats.
Souris Rapportrices : Protocole Détaillé
- Elevage des souris :
- Croiser des souris hétérozygotes pour l'allèle rapporteur FGF8 afin d'obtenir des embryons homozygotes, hétérozygotes et témoins.
- Prélèvement des embryons :
- Prélever les embryons aux stades de développement souhaités.
- Préparation des tissus :
- Fixer les tissus dans une solution de PFA à 4 %.
- Inclure les tissus dans de la paraffine ou les congeler dans de l'OCT (Optimal Cutting Temperature compound).
- Couper les tissus en coupes fines.
- Observation directe (pour GFP) :
- Si le gène rapporteur est la GFP, observer directement les coupes au microscope à fluorescence.
- Immunohistochimie (pour d'autres rapporteurs) :
- Si le gène rapporteur n'est pas directement visible, réaliser une IHC avec un anticorps spécifique au rapporteur.
- Analyse :
- Analyser la distribution du signal rapporteur dans les tissus embryonnaires.
Applications du Marquage de FGF8
Le marquage de FGF8 a de nombreuses applications dans l'étude du développement embryonnaire de la souris, notamment :
- Cartographie de l'expression de FGF8 : Déterminer les régions et les types cellulaires où FGF8 est exprimé à différents stades du développement.
- Identification des cibles de FGF8 : Identifier les cellules et les tissus qui répondent à la signalisation de FGF8.
- Analyse des effets de la perturbation de la signalisation de FGF8 : Etudier les conséquences de la perte ou du gain de fonction de FGF8 sur le développement embryonnaire.
- Etude des interactions de FGF8 avec d'autres voies de signalisation : Comprendre comment FGF8 interagit avec d'autres voies de signalisation pour réguler le développement embryonnaire.
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