Introduction
Les stratégies de production et de multiplication des arbres s’appuient traditionnellement sur des méthodes culturales classiques exploitant la multiplication végétative, un mode de propagation courant dans le règne végétal. Les horticulteurs ont ainsi développé des techniques artificielles comme le bouturage, le greffage et le marcottage, reproduisant des individus génétiquement identiques à la plante-mère et créant des populations homogènes. Les graines, issues de la fécondation, sont également utilisées pour la production de plants dans les programmes de reboisement. La multiplication végétative est privilégiée lorsqu'elle est économiquement viable, car elle permet une meilleure conservation des caractéristiques génétiques des plantes. L'utilisation de graines "tout-venant" peut entraîner une hétérogénéité considérable de la descendance.
L'introduction des techniques de multiplication végétative in vitro, ou vitrométhodes, a transformé la production végétale au cours des dernières décennies. Ces techniques offrent de vastes possibilités pour les études fondamentales et appliquées à la micropropagation d’espèces économiquement importantes ou utiles pour le reboisement de zones touchées par la désertification. Pour les pays du Sud, comme ceux du Sahel, où les vergers à graines sélectionnées sont rares, des techniques in vitro simplifiées permettent de répondre concrètement à la demande lors des campagnes de reboisement.
Cet outil répond à trois objectifs majeurs : l’amélioration de l’état phytosanitaire des plantes, l’accroissement du taux et de la vitesse de multiplication des arbres-élites, et la propagation végétative d’espèces forestières qui ne se reproduisent pas par cette voie en conditions naturelles.
Méthodes de Multiplication In Vitro
Trois méthodes de micropropagation en masse des essences forestières sont proposées :
- La multiplication végétative in vitro, ou microbouturage in vitro.
- La multiplication par organogenèse directe, c'est-à-dire la néoformation de bourgeons ou multiplication par bourgeonnement adventif.
- L’organogenèse indirecte par embryogenèse somatique.
Les deux premières techniques permettent une production conforme de vitroplants et de plants génétiquement identiques au pied mère sélectionné, tandis que la dernière peut induire des instabilités génétiques. Ces modifications génomiques peuvent être exploitées en génétique d'amélioration des plantes, car elles peuvent générer des caractères intéressants sur le plan agronomique ou agroforestier.
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Quelle que soit la technique utilisée, la micropropagation in vitro d'espèces ligneuses comporte une phase en laboratoire, une phase en serre et une phase au champ en conditions naturelles.
Multiplication Végétative In Vitro : Micropropagation des Espèces Ligneuses
Caractéristiques des Espèces Ligneuses
Chez les ligneux, la durée de vie de la plante peut être considérable. La plupart des arbres forestiers présentent une grande variabilité dans leur vitesse de croissance. Par conséquent, l'identification d'individus ayant des caractéristiques forestières requises se fait par sélection clonale, ce qui permet d'améliorer la qualité du matériel végétal. À l'issue de cette sélection clonale préliminaire, les arbres-mères qui donnent une descendance élite sont propagés par des techniques issues de la culture in vitro, comme la micropropagation.
Le stade de développement est un aspect important dans la micropropagation des espèces ligneuses, car les sujets adultes perdent progressivement leur aptitude à la propagation végétative du fait de leur vieillissement. Les explants juvéniles ou rajeunis réagissent mieux en culture in vitro que ceux provenant de matériel adulte. La morphogenèse et la croissance des tissus des explants sont fortement dépendantes du génotype et du statut physiologique de ces explants au moment de leur mise en culture.
Les autres difficultés rencontrées dans la multiplication in vitro des ligneux sont liées :
- Aux fortes contaminations des explants et à la difficulté d’obtenir une culture axénique.
- À la libération de substances phénoliques dans le milieu de culture.
- Au statut de la plante-mère, à savoir son génotype et son état nutritionnel.
- À la phase d’enracinement, qui présente toujours des difficultés chez les ligneux.
- Enfin, à l’âge ontogénique et physiologique de l’arbre.
Techniques de Multiplication
Les techniques de multiplication sont analogues à celles appliquées sur les espèces herbacées. Elles consistent à mettre en culture des microboutures, puis à stimuler le débourrement des bourgeons axillaires qui renferment un méristème et à les faire proliférer tout en maintenant l’intégrité génétique des clones. Toutefois, cette technique comporte quelques particularités qui sont des facteurs spécifiques aux espèces ligneuses. Elles concernent la composition du milieu de culture, la phase d’initiation in vitro, l’acquisition de certains caractères juvéniles résultant d’un rajeunissement progressif au cours de la culture et l’induction de l’enracinement adventif.
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Les tissus des plantes ligneuses se développent mieux dans des milieux dérivés du milieu de Murashige et Skoog (1962) dont les macro-éléments sont dilués de moitié ou au quart. Un milieu de culture spécifique aux espèces ligneuses, « Woody Plant Medium », a été mis au point par Mc Cown et Lloyd (1981).
Qu’il s’agisse d’une multiplication végétative par bourgeonnement axillaire ou par bourgeonnement adventif, il existe quatre stades-clés essentiels à respecter durant la phase en laboratoire :
- Stade 0 : Désinfection et préparation du matériel végétal à ensemencer in vitro.
- Stade 1 : Établissement de la culture aseptique initiale.
- Stade 2 : Phase de clonage in vitro, consistant en une multiplication des microboutures ou des bourgeons néoformés. Cette étape de subcultures est exécutée autant de fois que nécessaire selon le nombre de vitroplants final désiré et peut comporter une sous-étape d’allongement des microboutures selon les espèces.
- Stade 3 : Enracinement des vitroplants. Cette phase rhizogène peut se dérouler au laboratoire ou en serre.
Pour des raisons économiques, la phase d’enracinement in vitro, qui est l’étape la plus coûteuse et la plus délicate (représentant 35 voire 15 % du coût total de la technique), est souvent réalisée en même temps que la phase de sevrage sous serre.
Multiplication par Bourgeonnement Axillaire
Principe
Il s’agit de régénérer rapidement des milliers de plantes entières génétiquement conformes au pied-mère sélectionné, constituant ainsi un clone. Les fragments d’organes mis en culture, appelés explants, sont prélevés directement sur les plantes à propager. Il s’agit d’entrenœuds renfermant un bourgeon axillaire à l’aisselle d’une feuille. Ces explants sont cultivés in vitro dans un milieu synthétique approprié contenant des éléments minéraux essentiels et des régulateurs de croissance. Les concentrations hormonales déterminent l’expression et l’orientation morphogénétiques. Le repiquage s’effectue sous des conditions aseptiques rigoureuses.
Explants Juvéniles
Les explants juvéniles sont constitués par des boutures mononodales portant un bourgeon axillaire ou des apex terminaux de tiges de jeunes plantes sélectionnées, ou par des bourgeons cotylédonaires issus de semis de graines que l’on met en culture. Le bourgeon se développe en une tige feuillée par réactivation et croissance du méristème caulinaire qu’il renferme, car l’explant n’est plus soumis à l’influence des corrélations physiologiques inhibitrices de la plante. La réactivation et le développement du méristème sont induits par une phytohormone de nature cytokininique à faible concentration, incorporée dans le milieu nutritif approprié.
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La tige feuillée néoformée peut être fragmentée en microboutures mononodales constituées d’entrenœuds. Les entrenœuds sont transférés aseptiquement et individuellement dans le même milieu de culture neuf. Ils redonnent, au bout de 3 à 4 semaines d’incubation, autant de nouvelles tiges feuillées dont chaque entrenœud forme potentiellement un nouvel explant. Ce cycle de multiplication peut être répété autant de fois que nécessaire.
Si l’explant initial est ensemencé dans un milieu plus riche en cytokinines, le méristème caulinaire se transforme en une tige feuillée qui se ramifie intensément pour donner des rameaux secondaires voire tertiaires. Les touffes de bourgeons sont isolées et découpées, puis la phase de multiplication intensive est effectuée à ce stade. Dès que le taux de multiplication voulu est atteint, on procède à l’enracinement des tiges feuillées par transfert sur un milieu enrichi ou non en une hormone rhizogène, en l’occurrence de l’auxine. Par la suite, les vitroplants enracinés sont acclimatés en serre ou en pépinière où ils évoluent en plantes normales.
Dans le cas d’explant juvénile, il est possible d’obtenir une tige feuillée qui porte en moyenne 4 entrenœuds en 4 semaines, résultant d’un taux de multiplication égal à 4. Si la culture est initiée à partir d’une tigelle à 4 noeuds le 1er janvier, 12 mois plus tard (soit le 31 décembre) on pourra obtenir une progression géométrique de l’ordre de 412, correspondant à une production de 16 777 216 vitroplants.
Cette vitrométhode a été appliquée avec succès sur des espèces ligneuses tropicales en partant de noeuds prélevés sur de jeunes plants immobilisés en serre comme Anacardium occidentale L. et des acacias sahéliens, ou en utilisant des bourgeons cotylédonaires de semis de graines d’Eucalyptus camaldulensis Dehnh., d’Acacia albida Del. et d’Acacia mangium Willd.
L’intérêt du microbouturage in vitro est que cette technique accélère in vitro le fonctionnement normal des méristèmes des bourgeons préformés sur les plantes.
Explants Prélevés sur des Arbres Âgés
La multiplication des arbres âgés présente des difficultés liées à la reprise de croissance des organes et à leur port souvent plagiotrope. Afin d’éviter ces obstacles, on procède au “rajeunissement” de l’individu-élite sélectionné, on recherche sur l’arbre âgé des organes encore jeunes, ou l’on utilise des rejets. Une telle méthode a été utilisée au Sénégal pour micropropager in vitro des pieds âgés de Casuarina equisetifolia L. La technique consiste à collecter des inflorescences femelles immatures prélevées 3 semaines au plus tard avant l’épanouissement des fleurs de C. equisetifolia et à les introduire dans un milieu nutritif approprié.
Multiplication à Partir d’Explants Rejuvénilisés
Le rajeunissement du matériel végétal est recherché avant l’introduction in vitro, car les explants jeunes ou juvénilisés s’organisent mieux en culture in vitro que ceux provenant de matériel adulte. Par conséquent, le choix de l’explant sur un arbre adulte doit porter sur la partie de la plante qui a subi un rajeunissement. Celle-ci peut être naturelle (rejets émis à la base du tronc) ou provoquée artificiellement par recépage du tronc, par microgreffage en cascade in vitro sur des semis ou par applications de régulateurs de croissance.
Le microgreffage in vitro de la plupart des espèces ligneuses forestières est inspiré de la technique mise au point sur des Citrus L. Il permet de reconstituer des clones à partir de plantes âgées virosées ou inaptes au bouturage à cause des difficultés d’enracinement. Le microgreffage d’apex de tige provenant de sujets âgés sur des porte-greffes juvéniles a permis le rajeunissement physiologique de diverses espèces en facilitant leur enracinement et leur clonage in vitro, notamment Persea americana Mill., Eucalyptus camaldulensis, Citrus reticulata Blanco., Sequoia sempervirens Endl., Sequoia gigantum Bucholz., Acacia tortilis (Forssk.) Hayne et Zizyphus mauritiana Lam. var. Gola.
La technique consiste à insérer les greffons, issus de la cime de l’arbre âgé, sur des porte-greffes juvéniles élevés in vitro. Le greffon formé par un apex est tailladé à sa base en biseau et introduit dans la fente du porte-greffe, décapité au départ sous les cotylédons. Après débourrement et élongation des greffons, certains sont transférés sur un milieu d’enracinement puis acclimatés en serre pour l’endurcissement et l’appréciation des caractéristiques juvéniles (vigueur, port orthotrope, aptitude au bouturage, aptitude à l’enracinement, croissance, etc.).
Cette opération de microgreffage en cascade in vitro est répétée autant de fois que nécessaire, jusqu’à la rejuvénilisation du clone. Dès que les plants microgreffés présentent des caractères juvéniles, on procède à la phase intensive de microbouturage in vitro.
L’accroissement du taux de multiplication suite à plusieurs cycles de subculture dans des milieux riches en cytokinines induit aussi des caractères juvéniles qui peuvent être une réponse à la culture in vitro.
Multiplication par Organogenèse Directe : Bourgeonnement Adventif
Principe
Cette technique de micropropagation permet d’obtenir des bourgeons et pousses adventifs directement sur les tissus des explants blessés et mis en culture sans passer par une phase de callogénèse. Les bourgeons néoformés se forment à partir des cellules épidermiques, sous-épidermiques ou des cellules du système vasculaire.
La multiplication par bourgeonnement adventif est très utilisée pour la propagation d’espèces ornementales comme le Saintpaulia Wendl. ou le Ficus lyrata Warb., mais aussi pour la production d’essences forestières d’intérêt.
Applications Générales de la Culture In Vitro
La culture in vitro est une technique qui permet de régénérer une plante entière à partir de cellules ou de tissus végétaux cultivés en milieu nutritif et en conditions axéniques (sans aucun contaminant biologique). La culture in vitro d’explants ou de fragments prélevés sur la plante permet différentes applications :
- Micro-propagation : Reproduction et multiplication d'un individu en très grand nombre, à partir de cellules ou d’un fragment d’organe, par exemple à partir de nœuds ou de pousses axillaires. Mis en culture, ces tissus se développent et donnent une plante entière grâce à l’usage séquentiel de milieux nutritifs adaptés.
- Culture de méristèmes : Les méristèmes, formés de cellules non différenciées, sont à l’origine de tous les tissus de la plante. Leur intérêt réside dans le fait que ce sont des structures indemnes de virus. Leur culture permet de régénérer des plantes saines.
- Obtention d’embryons somatiques : L’embryogénèse somatique est la production d’embryons à partir de cellules non germinales (par exemple cellules méristématiques) soumises à un traitement hormonal. Après cette induction, il se produit une multiplication des cellules suivie d’une différenciation progressive des embryons en culture.
- Sauvetage des embryons : Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en culture in vitro et donner un nouvel individu, soit pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu’il ne pourrait pas se développer dans les tissus maternels, par exemple lorsqu’il résulte d’un croisement interspécifique.
- Haplodiploïdisation : Obtention d'individus haploïdes doublés à partir de cellules reproductrices. Ces cellules germinales contiennent une seule copie du génome (cellules haploïdes) au lieu des deux présentes dans les cellules somatiques (cellules diploïdes). Au cours de la régénération de la plante, on obtient le doublement à l’identique du génome haploïde par application d’un composé chimique, la colchicine, extrait de la colchique.
- Obtention de protoplastes : Les protoplastes sont des cellules débarrassées de la paroi pectocellulosique par hydrolyse enzymatique. Ils peuvent être obtenus à partir de différents tissus d’une plante, de préférence des limbes de jeunes feuilles. Limités seulement par la membrane cytoplasmique, les protoplastes peuvent fusionner, ce qui permet de créer de nouvelles variétés ou d’introduire des caractères à hérédité cytoplasmique. Des plantes transgéniques peuvent être obtenues à partir de protoplastes transformés par électroporation, une méthode qui permet d’introduire de l’ADN nu (construction génique) dans les protoplastes par l’utilisation d’un champ électrique de haut voltage qui rend perméable leur membrane cytoplasmique.
Culture In Vitro : Définition et Applications
La culture in vitro, souvent appelée culture cellulaire, est une technique essentielle en biologie cellulaire et moléculaire. Elle consiste à cultiver des cellules dérivées d'organismes multicellulaires dans un environnement contrôlé, généralement en dehors de leur contexte naturel. Cette méthode permet d’observer de près la croissance, la division et la fonction des cellules dans des conditions manipulées.
Origines et Développement
Les origines de la culture in vitro remontent au début du XXe siècle, avec des morceaux de tissus cultivés pour étudier leur survie et leur comportement en dehors de l'organisme. La technique a évolué pour inclure la culture de cellules individuelles, grâce à l'usage de milieux nutritifs spécialement conçus. Cette évolution a permis aux chercheurs d'examiner divers processus biologiques, tels que la réponse aux stimuli, la différenciation cellulaire et le métabolisme cellulaire. La culture in vitro a joué un rôle crucial dans de nombreuses découvertes scientifiques, notamment dans le développement de vaccins et la recherche sur le cancer.
Applications Notables
Les cellules HeLa, dérivées d'un cancer du col de l'utérus, sont un exemple célèbre de culture in vitro. Cultivées pour la première fois en 1951, elles sont encore utilisées aujourd'hui pour la recherche biomédicale et ont permis des avancées majeures dans le traitement du cancer, l'étude des virus et le développement de vaccins.
Techniques de Culture
Il existe plusieurs techniques pour effectuer une culture in vitro, chacune ayant des applications spécifiques basées sur les besoins de recherche ou industriels.
- Culture de cellules animales : Utilisée pour étudier les comportements cellulaires et tester des produits pharmaceutiques. Elle comprend les lignes cellulaires continues (prolifération indéfinie) et la culture primaire (isolation directe de tissus d'animaux).
- Culture de cellules végétales : Utilisée pour la production de plantes entières à partir de cellules uniques (totipotence), la culture de callus (amas de cellules non différenciées), l'utilisation de bio-réacteurs (culture à grande échelle) et la micropropagation (multiplication rapide de plantes).
Un exemple typique de culture de cellules végétales est la production de bananiers résistants aux maladies par micropropagation.
Applications Diversifiées
La culture in vitro a de nombreuses applications, notamment dans :
- La recherche biomédicale (tests de médicaments et recherche sur les maladies).
- L'agriculture (amélioration des cultures et propagation des plantes).
- La conservation (préservation des espèces rares ou en danger).
Cette technique permet également de manipuler génétiquement les cellules pour étudier les effets de certaines modifications génétiques, ce qui est crucial pour l'avancement de la biotechnologie.
Biotechnologie Végétale et Culture In Vitro
La biotechnologie végétale et la culture in vitro sont reconnues pour leurs contributions exceptionnelles à l'agriculture moderne et à la conservation des espèces. Ces techniques permettent la reproduction, le génie génétique et la protection environnementale.
Principes Fondamentaux
La culture in vitro en biotechnologie végétale se base sur la manipulation des cellules et des tissus dans un milieu contrôlé. Les principes fondamentaux incluent :
- La sélection des explants (utilisation de petites parties de la plante).
- Le milieu de culture (composé de nutriments, hormones et sucres).
- Les conditions aseptiques (essentielles pour éviter la contamination).
Un exemple concret est la conservation et la multiplication rapide de plantes médicinales rares.
Mutations Fonctionnelles
La culture in vitro peut être employée pour induire des mutations fonctionnelles chez les plantes, permettant le développement de nouvelles variétés ayant des caractéristiques bénéfiques, telles que la résistance accrue aux maladies ou une teneur améliorée en nutriments.
Application en Environnement Contrôlé
L'application de la culture in vitro dans divers environnements a transformé la manière dont les scientifiques abordent la recherche en biologie. En recréant des conditions naturelles contrôlées, cette technique est utilisée pour de nombreuses expériences allant de la croissance cellulaire jusqu'à la manipulation génétique.
Exemples Concrets
La culture in vitro est principalement observée dans des laboratoires spécialisés. Voici quelques exemples :
- Recherche médicale : Les cellules humaines sont cultivées pour tester l'efficacité des nouveaux médicaments avant les essais cliniques.
- Génétique : La culture in vitro permet la manipulation de l'ADN pour étudier l'expression des gènes spécifiques.
- Pharmacologie : Test de la réaction des cellules à différents composés chimiques pour découvrir de nouveaux traitements.
Dans les essais de chimiosensibilité, des cellules cancéreuses prélevées chez un patient sont cultivées in vitro pour déterminer la réponse aux agents chimiothérapeutiques et personnaliser le traitement.
Biotechnologie Marine
En biotechnologie marine, la culture in vitro est employée pour restaurer des environnements coralliens menacés. En isolant et cultivant des fragments de corail, les chercheurs peuvent encourager la prolifération des coraux dans des conditions contrôlées avant de les réintroduire dans leur habitat d'origine.
Modélisation Mathématique
Une analyse rigoureuse du comportement cellulaire in vitro peut être décrite par des équations mathématiques utilisées pour modéliser divers aspects, y compris la vitesse de croissance. Par exemple, la vitesse de croissance ((r)) d'une culture cellulaire peut être décrite par l'équation logistique de croissance cellulaire suivante :
[ r(t) = r0 + \frac{K}{1 + \frac{K}{N0} \times e^{-rt}} ]
où (r0) est le taux de croissance intrinsèque, (K) la capacité de charge de l'environnement, et (N0) la population initiale.
Culture In Vitro vs. Culture In Vivo
La culture in vitro se déroule en dehors d'un organisme vivant, dans un environnement contrôlé comme une boîte de Petri, tandis que la culture in vivo a lieu à l'intérieur d'un organisme vivant. La culture in vitro permet un contrôle précis des conditions environnementales, réduit les contaminations et permet une observation et une manipulation directe des cellules.
Applications Alimentaires
La culture in vitro est utilisée pour produire des ingrédients alimentaires comme les arômes, les colorants et les additifs. Elle permet aussi le développement de viande cultivée, réduisant l'impact environnemental et évitant la souffrance animale.
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