L'étude du développement embryonnaire est un domaine crucial pour comprendre les mécanismes fondamentaux de la biologie. Parmi les modèles animaux utilisés, le xénope, en particulier Xenopus laevis et Xenopus tropicalis, occupe une place de choix. Leur développement rapide et la facilité avec laquelle on peut le suivre font de ces amphibiens un outil précieux pour les chercheurs.
Pourquoi le Xénope ? Avantages et particularités
Plusieurs caractéristiques font du xénope un modèle d'étude privilégié :
- Suivi aisé du développement précoce : Le développement de l’embryon précoce est facilement suivi, permettant aux chercheurs d'observer les différentes étapes de la formation de l'organisme.
- Rythme de développement modulable : Leur développement est rapide et sa progression peut être modulée par la température selon les besoins de l’expérimentateur. Il est important d'éviter des changements trop violents, notamment lors de la gastrulation, car cela peut amener à des malformations.
- Visualisation de la gastrulation : Le xénope est un modèle où on peut très facilement voir les mouvements de la gastrulation, une étape clé du développement embryonnaire.
- Facilité de manipulation génétique : L’expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l’aide de microinjections d’ARNm et d’oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
Diversité des espèces : Xenopus laevis et Xenopus tropicalis
Deux espèces de Xenopus sont utilisées dans la recherche sur le développement : X. laevis et X. tropicalis. Chaque espèce offre des avantages spécifiques. Xenopus laevis produit de gros embryons qui sont excellents pour la microchirurgie embryonnaire, l’analyse de la surexpression des gènes, les études biochimiques. De son côté, Xenopus tropicalis est un organisme diploïde qui facilite les études de perte de fonction. Les ovocytes et les embryons de Xenopus tropicalis sont cependant plus petits que ceux de Xenopus laevis.
Applications et techniques utilisées
Microinjection et Morpholinos
L'expression des gènes dans les embryons de xénope peut être facilement manipulée à l'aide de microinjections d'ARNm et d'oligonucléotides morpholino antisens (MO) pour un gain ou une perte de fonction, respectivement.
Un morpholino (MO) antisens inhibant l’expression de Pax3 est injecté dans un blastomère d’un embryon de xénope au stade 2 cellules. On injecte également l’ARNm qui code la β-galactosidase. On laisse se développer l’embryon jusqu’au stade désiré (ici neurula), on le fixe, on révèle l’activité de la β-galactosidase avec du RedGal (points rouges) pour savoir de quel côté de l’embryon se trouvent les cellules issues du blastomère injecté puis on le traite en hybridation in situ avec une sonde reconnaissant l’ARNm du gène Ak3 (marquage bleu). On constate que l’expression du gène Ak3 est diminuée du côté injecté par le MO anti-Pax3, montrant que (directement ou indirectement) Pax3 est nécessaire à la bonne expression de ce gène.
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Création d'animaux transgéniques
Un autre avantage majeur de l’utilisation de Xenopus pour étudier le développement est la capacité de générer des animaux transgéniques. L’incorporation d’ADN exogène dans le génome d’un zygote a été développée chez Xenopus tropicalis et Xenopus laevis à la fin des années 1990. Lorsqu’il correspond à un rapporteur fluorescent comme la GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique, l’expression d’un transgène peut être surveillée au fil du temps dans un embryon vivant en développement. Des lignées rapportrices, par exemple de l’activité d’une voie de signalisation, peuvent être étudiées.
CRISPR/Cas9
La technique CRISPR/Cas9 peut être utilisée pour créer des mutations gain ou perte-de-fonction ou générer des lignées rapportrices.
Représentation schématique de la mutagenèse ciblée du gène de la tyrosinase (tyr), comme exemple de processus pour créer des mutants. Les mutants homozygotes au locus tyr présentent un albinisme oculocutané. L’ARNm ou la protéine Cas9 est co-injecté avec un ARNsg spécifique de tyr dans des zygotes (en haut à gauche). Les embryons F0 sont des mosaïques : ils sont constitués de populations de cellules contenant différents allèles mutants et de tissus de type sauvage (Les quantités relatives de cellules mutants par rapport aux cellules normales sont probablement fonction à la fois du moment de la mutagenèse et de l’efficacité des sgRNA individuels pour diriger Cas9 vers les sites cibles). Dans le cas du ciblage de tyr, la perte biallélique de fonction du gène entraîne un déficit de synthèse de mélanine, qui se manifeste par une perte de pigmentation des yeux et de la peau. Les animaux mosaïques F0 peuvent être croisés pour produire des mutants non mosaïques (hétérozygotes ou homozygotes composés) (tyr−/−), ainsi que des porteurs (tyr+/−) et une progéniture F1 de type sauvage. Tout dépendra si les cellules mutées ont participé à former les gamètes de F0.
Analyse comparative des structures
En plus des méthodes perte- et gain-de-fonction efficaces et peu coûteuses, Xenopus présente des avantages pour l’analyse comparative des structures. En effet, l’injection d’une seule cellule de l’embryon à deux cellules peut cibler le côté gauche ou droit de l’embryon. En utilisant des traceurs fluorescents (GFP) ou enzymatiques (β-galactosidase), on peut facilement détecter le côté injecté de l’embryon et le comparer au côté non injecté. De telles manipulations sont très utiles car elles fournissent un contrôle interne chez le même animal pour chaque expérience.
En plus de l’injection au stade 2 cellules, les embryons de xénope ont une carte du destin cellulaire bien définie pour chaque système organique. Cela permet des injections ciblées, où l’expression des gènes peut être modifiée dans des organes ou des tissus spécifiques. Les embryons de xénope et notamment de Xenopus laevis qui sont plus gros se prêtent très bien à des expériences de microchirurgie embryonnaire.
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Culture cellulaire
Le xénope est aussi utile pour produire des cultures cellulaires de cellules pluripotentes : les cellules de la calotte (ou coiffe) animale, prélevées sur des blastulas. Sans intervention, ces cellules finissent par se développer en petits organoïdes épidermiques.
Étapes clés du développement embryonnaire chez le Xénope
La rotation d'orientation corticale
En embryogenèse, la rotation d'orientation est un mouvement de rotation de l'oeuf entier selon la pesanteur, après la réaction corticale qui a libéré la membrane plasmique de la membrane vitelline. Le pôle végétatif se trouve alors en bas, car il est le plus lourd (chargé de réserves). Il s'agit d'une rotation d'équilibration.
Résumé des événements supposés provoquer l'induction de l'organisateur dans le mésoderme dorsal. La rotation d'orientation corticale provoque la translocation de la protéine Disheveled vers la face dorsale de l'embryon. Dsh se lie à GSK-3, permettant ainsi à la β-caténine de s'accumuler dans la future partie dorsale de l'embryon. Lors du clivage, la β-caténine pénètre dans les noyaux et se lie au Tcf3 pour former un facteur de transcription qui active les gènes codant pour des protéines telles que Siamois. Siamois et Lim-1, un facteur de transcription activé par la voie TGF-β, fonctionnent ensemble pour activer le gène goosecoid dans l'organisateur. La protéine homéobox goosecoid (GSC) est un facteur de transcription capable d'activer des gènes dont les protéines sont responsables des activités de l'organisateur.
Le rôle de l'organisateur de Spemann
L’expérience de Spemann et Mangold réalisée en 1924 est une des expériences fondatrices de la biologie du développement. Elle consiste en la greffe de la lèvre dorsale du blastopore d’une jeune gastrula d’amphibien sur la région ventrale d’un autre amphibien. On obtient alors un embryon puis une larve qui possède deux axes dorsaux c’est-à-dire deux tubes neuraux, deux cordes, deux séries de somites.
Quand on distingue ce qui provient du donneur et ce qui provient du receveur (Spemann et Mangold ont pu le faire car le donneur et le receveur appartenaient à deux espèces de triton avec une pigmentation différente), on constate que la quasi-totalité du tube neural et des somites supplémentaires proviennent du receveur et que la corde provient du donneur. Donc, tandis que la lèvre dorsale du blastopore greffée s’est développée en corde, elle a induit les tissus ventraux alentour à donner du tissu nerveux et des somites. Sans ces signaux, les tissus ventraux auraient donné de l’épiderme et du mésoderme ventral (cellules sanguines par exemple).
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Il a souvent été présenté dans son rôle de mise en place de l’axe DV mais il est également important pour l’axe AP et l’asymétrie droite/gauche.
La rotation corticale
Ces évènements sont liés à la rotation corticale qui suit la fécondation où le cytoplasme du zygote juste sous la membrane plasmique se déplace d’un angle de 30° vers le point d’entrée du spermatozoïde. La calotte pigmentaire de l’hémisphère animal bascule vers le point d’entrée du spermatozoïde laissant à l’opposé de celui-ci des traînées de pigment cortical qui prennent la forme d’un croissant d’où le terme de croissant gris (CG). Après cet événement, la future région dorsale de l’embryon apparaîtra du côté le plus clair du zygote.
L’une des protéines déplacées est Dishevelled qui est accrochée à des vésicules transportées le long de faisceaux parallèles de microtubules. Ces vésicules se déplacent très vite, à la vitesse de 25-40 μm/min. Dishevelled protège du côté dorsal la β-caténine de la destruction induite par GSK3β (voir le chapitre consacré aux voies de signalisation Wnt). Le ligand Xwnt11 est également nécessaire à cette étape pour renforcer la protection de la β-caténine ainsi que la protéine Huluwa qui dégrade Axine1, une protéine qui facilite la dégradation de la β-caténine. β-caténine s’accumule alors sur la face dorsale de l’embryon et entre dans le noyau au stade 16 cellules. Elle s’associe aux facteurs de transcription LEF/TCF.
L’organisateur de Spemann se met en place à la convergence entre deux voies de signalisation complémentaires : la voie de la β-caténine qui est activée dans la région dorsale par la rotation corticale et la voie Nodal (ou Xnr chez le xénope) dont l’expression des ligands est activée dans l’endoderme par le facteur de transcription VegT. Une forte concentration en Xnr est nécessaire pour induire du mésoderme dorsal (et donc un organisateur de Spemann).
L'expression des gènes Xnr
L'expression des gènes Xnr1, 2 et 4 s'effectue principalement dans l'hémisphère végétatif et la région dorsale. La détection in situ de Xnr1, 2 et 4 montre bien que leur expression est bien endodermique mais située dans la zone marginale. Au début de la gastrulation, elle affecte un gradient dorsoventral décroissant qui apparaît au cours de la période de clivage.
L'expression des gènes Xnr1, 2 et 4 est régulée en amont par VegT. Cette régulation peut être directe on indirecte. On sait cependant, que le promoteur de Xnr1 possède un site de fixation pour le facteur de transcription VegT, ce qui suggère dans ce cas précis que Xnr1 soit directement activé par VegT.
Applications historiques et découvertes fondamentales
Le xénope n’a pas été que utile pour étudier le développement embryonnaire stricto sensu mais a aussi permis des avancées dans des domaines de génétique et de biologie cellulaire plus fondamentaux.
- Test de grossesse de Hogben : Utilisation historique de Xenopus laevis comme test de grossesse (test de Hogben). De l’urine en provenance de la femme dont on veut savoir si elle enceinte est injecté dans une femelle Xénope. Si au bout de 48 heures, une ponte s’est déclenchée, cela veut dire que l’urine de la femme contenait de l’hCG (ou hormone chorionique gonadotropique) produite par le placenta et qui a provoqué la ponte des xénopes.
- Mise en évidence de CSF : La maturation de l’ovocyte entraîne une augmentation de l’activité du MPF (Maturation Promoting Factor qui est la cycline B - CDK1), qui culmine lors de l’ovulation, maintenant l’ovocyte en arrêt de cycle en métaphase II grâce au CSF (Cytostatic Factor). Cet arrêt est levé après la fécondation, entraînant une chute de l’activité MPF et le début des divisions cellulaires du zygote (stades 2, 4 puis 8 cellules). Si on réalise un transfert cytoplasmique d’un ovocyte mature non fécondé vers l’une des cellules d’un embryon à 2 cellules, cette cellule ne se divise plus (elle est dit « en arrêt CSF ») démontrant la capacité du cytoplasme de l’ovocyte mature à maintenir l’activité MPF et à bloquer le cycle.
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