Introduction
La souris domestique (Mus musculus) est un modèle mammifère exceptionnel pour explorer une variété de traits et de maladies, en particulier ceux liés au développement. Cet article explore en profondeur le développement embryonnaire de la souris femelle, en abordant les aspects génétiques, les techniques de manipulation embryonnaire, et les implications éthiques de la recherche dans ce domaine.
La Souris en tant que Modèle d'Étude
L'introduction de la souris comme modèle en génétique remonte au début du XXe siècle, simultanément avec l'utilisation de la drosophile. Lucien Cuénot a utilisé des souris pour démontrer les lois de Mendel chez les mammifères entre 1902 et 1905. William E. Castle a également contribué en étudiant l'hérédité de la couleur du pelage chez la souris. La création de la première souche consanguine, DBA, en 1909, a marqué le début de la génétique moderne de la souris.
L'organisation du génome a considérablement divergé entre l'homme et la souris depuis leur ancêtre commun, avec environ 180 cassures et réassemblages dans les lignées humaine et murine. Bien que le nombre de chromosomes soit similaire (23 chez l'homme contre 20 chez la souris), leurs structures globales diffèrent considérablement. Néanmoins, il existe de nombreux blocs d'ADN où l'ordre des gènes est conservé entre les deux espèces, un phénomène appelé synténie.
La souris est un excellent modèle pour étudier les étapes précoces du développement, telles que le clivage et les étapes post-gastrulation.
Étapes Clés du Développement Embryonnaire de la Souris
Fécondation et Clivage
Par traitement hormonal, on fait superovuler des souris femelles puis on les accouple avec un mâle. Les zygotes sont rapidement récupérés dans les voies génitales puis incubés in vitro.
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Formation du Blastocyste
À E3,5, l’ensemble épiblaste/endoderme primitif s’appelle la masse cellulaire interne. La structure d’un blastocyste de souris à E4,5 révèle des populations cellulaires exprimant des marqueurs spécifiques.
Gastrulation et Organogenèse
Pour la période juste après l’implantation correspondant à la gastrulation, les embryons ont une taille et une topologie qui les rendent difficiles à étudier dans l’utérus. Des techniques récentes de culture d’embryons in vitro ont permis de faire se développer des embryons de souris jusqu’à 11 jours après fécondation soit jusqu’à l’organogenèse !
Lignages Cellulaires
Le lignage général de l’embryon de souris et de ses annexes montre que certaines cellules ne participent qu’à des annexes extraembryonnaires, tandis que d'autres donnent des cellules des annexes et des cellules de l’embryon. Les lignages de la souris entre E3,5 et E13,5 sont déduits des études de transcriptomiques sur cellules isolées (scRNAseq).
Techniques de Manipulation Génétique chez la Souris
Création de Souris Transgéniques
L’ADN d’intérêt, souvent un gène sous le contrôle d’un promoteur spécifique est injecté dans le pronucléus mâle. Puis on sélectionne les embryons qui ont poursuivi correctement leur développement et on les injecte dans l’utérus d’une femelle pseudo-gestante (la copulation provoque des stimuli mécaniques nécessaires au bon développement de l’utérus pour la gestation alors la femelle est préalablement accouplée avec un mâle vasectomisé). Les souriceaux nés doivent ensuite être sélectionnés pour la présence et l’expression du transgène. En effet, l’insertion du transgène dans le génome ne réussit pas à chaque fois et le transgène peut aussi très bien s’être inséré dans de l’hétérochromatine silencieuse. On effectue une RT-PCR ou alors un test qui permet de révéler l’expression d’un gène rapporteur s’il est présent dans le transgène (par exemple, coloration X-gal si on a mis le gène de la β-galactosidase).
Knock-out et Knock-in
La mutation par recombinaison homologue est réalisée dans des cellules ES (embryonnaires souches) pluripotentes. Ces cellules sont injectées dans la masse cellulaire interne de blastocyste sauvage et l’embryon chimérique ainsi généré est transféré dans une mère porteuse. On obtient des souriceaux chimériques et certains d’entre eux ont leur lignée germinale formée à partir des cellules mutées (descendantes des cellules ES injectées dans les blastocystes). On croise ces souris avec des souris normales. A la génération suivante, la moitié des souris aura toutes leurs cellules hétérozygotes pour la mutation. On croise alors ces souris entre elles et un quart de leur descendance sera homozygote pour la mutation introduite.
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CRISPR/Cas9
Un ou deux ARN guide (sgRNA) sont conçus pour soit perturber un exon critique (knockout), soit supprimer un exon entier pour le remplacer par une séquence au choix (knockin). Les sgRNA sont synthétisés, ou transcrits in vitro, puis complexés avec le tracrRNA puis la protéine Cas9 pour former un complexe ribonucléoprotéique (RNP). Les RNP sont électroporés in situ dans l’oviducte d’une femelle gravide avec un long ADN simple brin qui servira de matrice à la réparation (ssODN). Les descendances sont génotypées pour vérifier l’édition réussie du gène d’intérêt. La deuxième procédure est nettement moins couteuse et nettement moins longue.
Système Cre-Lox
Les knock-out abolissent la fonctionnalité d’un gène depuis le début de son expression. Or parfois un gène peut avoir des fonctions à différents moments du développement. S’il a un rôle vital à une phase précoce, un knock-out ne permettra pas de connaître sa fonction à des phases tardives. Le système Cre-Lox a permis de franchir cet obstacle en rendant possible une délétion d’un gène contrôlée spatio-temporellement au cours du développement. La Cre est une recombinase du bactériophage P1 qui est capable d’exciser toute séquence située entre deux séquences LoxP.
Innovations Récents dans la Reproduction de la Souris
Parthénogenèse Artificielle
En Chine, une équipe de chercheurs a annoncé avoir réussi à faire naître des souriceaux de deux souris femelles. Ils ont utilisé des cellules souches embryonnaires haploïdes et l’édition ciblée du génome. Devenues adultes, les souris ont pu à leur tour donner naissance à des souriceaux en bonne santé. Pour « un développement viable de l’embryon », l’empreinte parentale permet d’inactiver soit le gène maternel, soit le gène paternel afin qu’une seule des deux copies du gène ne s’exprime. « Pour contourner ce mécanisme », les chercheurs ont réalisé une parthénogenèse en injectant dans les ovocytes de souris des cellules souches embryonnaires haploïdes faisant office de spermatozoïdes. Le plus souvent, ces cellules souches haploïdes sont dérivées d’ovocytes en cours de division par un traitement chimique et électrique. Les embryons transférés se sont développés jusqu’au terme. Sur 210 embryons, 29 souris sont nées viables et se sont reproduites.
Création d'une Souris sans Ovocyte
Une équipe anglo-allemande a rendu viables des embryons en leur injectant un spermatozoïde. Une technique qui pourrait venir en aide aux espèces menacées. Toru Suzuki et ses collègues ont démontré pour la première fois que, chez la souris, on peut obtenir un individu unique à partir d’embryons et de spermatozoïdes sans recourir à des ovocytes. Dans ce travail expérimental, les scientifiques ont utilisé des embryons de souris à un stade très précoce, avant la première division cellulaire. Ces embryons ont subi un traitement chimique afin d’activer la division cellulaire pour qu’ils ne possèdent plus qu’un seul jeu de chromosomes et donc qu’une moitié de matériel génétique. Ils deviennent alors haploïdes et on les appelle des parthénogénotes. Dans chacun d’entre eux, un spermatozoïde a été ensuite injecté, comme on le ferait dans une fécondation in vitro avec un ovocyte, pour apporter l’autre moitié de matériel génétique. En réimplantant ces cellules fusionnées dans des souris jouant le rôle de mères porteuses, les chercheurs ont obtenu, dans un quart des tentatives, des souriceaux apparemment en bonne santé.
Considérations Éthiques
Ces techniques soulèvent de nombreuses questions éthiques, notamment concernant l'utilisation potentielle de ces méthodes chez l'espèce humaine. Pour le docteur Dusko Ilic, il est peu plausible que ce genre de technologie puisse être appliqué à l’homme dans un avenir proche. Bernard Jégou souligne que, au-delà de l’amélioration des connaissances et d’un nouvel éclairage sur les mécanismes de la reproduction, il est trop tôt pour dire ce que l'on fera de ces résultats. Ces avancées brouillent les distinctions fonctionnelles entre lignées cellulaires sexuelles, embryonnaires et somatiques.
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Protocole de Superovulation et Prélèvement d'Embryons
Les souris femelles jeunes adultes seront super-ovulées: elles auront une injection intraperitonéale de deux hormones à 48 ou 72h d’intervalle. Les femelles sont accouplées avec des mâles fertiles juste après l’injection de la seconde hormone et les bouchons vaginaux sont relevés le lendemain matin (preuve de l’accouplement). Elles seront alors euthanasiées pour effectuer le prélèvement des embryons au stades souhaités. En cas d’absence de bouchon vaginal, les souris peuvent être gardées en quarantaine 3 semaines avant de suivre un nouveau cycle de superovulation. Cette procédure invasive pouvant générer une souffrance animale pour cette étude sera une double injection d’hormone à 48h ou 72h d’intervalle pour super-ovuler les souris femelles.
Application de la Règle des "3R"
Remplacement
Du fait des connaissances actuelles en particulier sur le développement embryonnaire, et de la disponibilité d’outils génétique performants, la souris est le modèle mammifère le plus adapté pour ce projet. Malgré les progrès récents dans la culture de cellules ayant des caractéristiques proches de celles présentes lors du développement précoce, l’embryon de modèles animaux reste le système modèle le plus avancé et le plus approprié pour étudier les mécanismes moléculaires de ce stade biologique.
Réduction
(i) La super-ovulation optimisée permettra d’accroitre le nombre d’embryons par souris femelle et la qualité de ces derniers. Cela contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés. (ii) Pour accroitre le nombre d’embryon de bonne qualité, l’intervalle de temps entre les injections hormonales sera optimisé. (iii) Afin de limiter les mises au point avec des embryons, la qualité des anticorps sera validée au préalable en utilisant du matériel biologique dérivé de cellules les plus adaptées. (iv) Afin de limiter le nombre de souris mâle utilisée, les souris mâles fertiles seront réutilisées autant que possible.
Raffinement
Pour un traitement optimisé, les deux hormones seront injectées en fonction du poids des animaux et en utilisant des sites d’injection différents. Les injections seront rapides et ne nécessitent pas de dérogation aux conditions règlementaires d’élevage (maintien des groupes sociaux, maintien de l’enrichissement). Les prélèvements pour le génotypage seront effectués à un stade de développement minimisant la souffrance.
Reproduction Naturelle chez la Souris
Une seule souris peut donner naissance à une cinquantaine de petits en une seule année, voire plus, qui deviennent sexuellement matures avant l’âge de 2 mois. Chez les souris, le mâle atteint sa maturité sexuelle à l’âge de 8 semaines et la femelle à seulement 6 semaines. Il n’y a pas de saison de reproduction particulière chez ces rongeurs qui peuvent avoir des souriceaux tout au long de l’année. Le mâle est fertile jusqu’à la fin de sa vie tandis que la femelle, qui ovule tous les 5 jours (chaleurs), a une fertilité qui décline et s’interrompt aux alentours de 18 mois.
Avant l’accouplement, le mâle et la souris se reniflent, se lèchent le museau. La saillie est très rapide, ne durant tout au plus que quelques secondes pendant lesquelles la femelle, chevauchée par le mâle, pousse des cris aigus. Mais avant cela, elle ne se laisse pas courtiser facilement, repoussant tout d’abord les assauts de son prétendant à plusieurs reprises avant d’accepter l’accouplement.
Une souris peut avoir jusqu’à 8 portées en un an, chacune pouvant compter entre 6 et 10 petits, mais dans des cas plus exceptionnels on dénombre jusqu’à 21 souriceaux en une seule portée ! On recommande toutefois de ne lui accorder que deux portées au cours de sa courte vie, ce qui permet de préserver sa santé. La gestation dure 20 jours pour une portée modérée et jusqu’à 23 jours si le nombre de souriceaux est important, c’est-à-dire s’il dépasse la moyenne. Cette dernière précaution limite les risques de voir la petite femelle de nouveau fécondée juste après la naissance des souriceaux. De plus, la souris doit être sereine afin de pouvoir aménager son nid, ce qui a généralement lieu dans la semaine qui précède la mise-bas. C’est dans la majorité des cas au cours de la période nocturne que les souris mettent bas. Dans des conditions normales, la naissance des souriceaux issus d’une grosse portée se déroule en moins de 90 minutes.
Comme on peut le constater chez de nombreux mammifères, la mère mange le placenta de chacun de ses rejetons et coupe elle-même chaque cordon ombilical. Il faut toujours vérifier que la femelle a expulsé autant de placentas que de souriceaux. Si ce n’est pas le cas, sa santé est mise en péril. La souris est attentionnée, s’occupe bien de ses petits.
Cannibalisme chez les Souris
On peut dans certains cas déplorer un acte de cannibalisme chez les souris. Les mères sont en effet susceptibles de manger leurs petits à la naissance lorsque les souriceaux sont trop nombreux (grosse portée). Dans ce cas de figure, une mère souris mange ceux qu’elle juge excédentaires comme les plus faibles. Le cannibalisme a lieu également chez les souris victimes de sous-alimentation pouvant entraîner des difficultés à allaiter ou des carences. On conseille de bien nourrir la souris gestante et lorsqu’elle a mis bas afin que son organisme reçoive suffisamment de vitamines, de minéraux et d’oligo-éléments. Le cannibalisme est aussi un phénomène que l’on rencontre chez quelques souris primipares, ce sont celles qui ont des petits pour la première fois de leur vie, car la gestation peut générer du stress. Dans ces cas précis, le cannibalisme peut être considéré comme normal.
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